人胚肝细胞分离培养研究

目的　探讨体外优化培养人胚肝细胞的方法。方法　采用胰蛋白酶和聚乙烯吡咯烷酮(pvp) ,胶原酶,胶原酶和pvp消化法分离人胚肝细胞,并比较3种方法对分离人胚肝细胞的效果。结果　运用这三种方法均能成功地培养出原代肝细胞,并能够传代;但胶原酶和pvp消化法分离细胞效果最好,细胞贴壁生长能力强。三种消化方法其细胞存活率从高到低依次为胶原酶和pvp消化法、胶原酶消化法、胰蛋白酶和pvp消化法。结论　人胚肝细胞的分离首选胶原酶和pvp消化法,使用该法在体外培养的人胚肝细胞生长良好,可用于肝细胞移植和生物人工肝等方面的研究。     

不同感染状态下人巨细胞病毒基因活性的实验研究

目的探讨人巨细胞病毒(HCMV)潜伏和活动性感染状态下病毒基因复制特点。方法选择两种不同滴度HCMV感染传代培养的人胚肺成纤维细胞,建立持续稳定感染和活动感染细胞模型。在感染不同时段,分别采用FQ-PCR和RT-PCR法监测HCMVDNA复制及其主要衣壳蛋白(MCP)mRNA转录情况,光镜观察致细胞病变作用(CPE)、电镜检查细胞超微结构改变。结果两组细胞内均检测到HCMVDNA复制,但活动性感染的B组细胞内HCMVDNA负荷量显著高于A组(P<0.05),其复制速度也较快,并且检测到了水平逐渐升高的MCPmRNA转录,细胞出现进行性加重的CPE和超微结构改变;而潜伏感染的A组未检到MCPmRNA,亦未发现细胞病变。结论高负荷量HCMVDNA复制和晚期蛋白MCPmRNA转录是HCMV活动性感染的重要特点。     

二甲亚砜对人巨细胞病毒初次分离促进作用的实验观察

目的观察二甲亚砜(DMSO)对人巨细胞病毒(HCMV)初次分离的影响.方法将临床收集的11例患者尿标本接种至两组人胚成纤维细胞(HF)细胞中进行HCMV分离.1组为DMSO细胞组,即在培养液中添加了终浓度为1%的DMSO;另1组为常规细胞组接种组,设为对照,不作任何处理.待细胞出现HCMV特征性细胞病变(CPE)时,通过PCR法测定HCMV DNA加以确证.结果 11例标本中,两组均有5例标本出现HCMV CPE,且标本号一致.但DMSO细胞组CPE出现时间比对照组提前约9 ～12 d.结论 DMSO对HCMV初次分离的阳性结果没影响,但可使HCMV特征性CPE的出现得以提前,加快了临床标本中HCMV的分离.     

人胚脾LAK细胞体外抗肿瘤作用的实验研究

本文对人胚脾ＬＡＫ细胞的制备及其体外抗肿瘤作用进行了实验研究，为临床推广应用提供了可行性的依据。实验表明，在红细胞低渗休克法，溶血盐法，淋巴细胞分离液分离法中，以最后一种方法制备人胚脾ＬＡＫ前体细胞的效果最佳。用重组白细胞介素２诱导的人胚脾ＬＡＫ细胞在培养的第５～８ｄ对Ｋ５６２靶细胞的细胞毒活性最高，达６５．１％；而对Ｒａｊｉ靶细胞的细胞毒活性较低，在培养的第５ｄ为２６．７％。由此可见，人胚脾ＬＡＫ细胞对Ｋ５６２和Ｒａｊｉ两种肿瘤细胞均有杀伤活性。     

杂色曲霉素体对人胚肺细胞致恶性转化作用的研究

目的：研究杂色曲霉素对人肺组织的致癌作用。方法：以组织培养方法研究了杂色曲霉素体外对人胚肺细胞致恶性转化作用。发现染色曲霉素处理４周后，体外培养的人胚肺细胞增殖旺盛，并出现细胞异型性变化，并可见复层交叉生长的转化灶。杂色曲霉素处理２４周，处理细胞可在软琼脂培养基上集落，杂色曲霉素１μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ组平均集落数分别为１５．３、１６．１个／皿。结论：杂色曲霉素可诱发体外增减的人胚肺细胞发生恶化     

杂色曲霉素体外对人胚肺细胞致恶性转化作用的研究

目的：研究杂色曲霉素对人肺组织的致癌作用。方法：以组织培养方法研究了杂色曲霉素体外对人胚肺细胞致恶性转化作用。结果：发现杂色曲霉素处理４周后，体外培养的人胚肺细胞增殖旺盛，并出现细胞异型性变化，并可见复层交叉生长的转化灶。杂色曲霉素处理２４周，处理细胞可在软琼脂培养基上形成集落，杂色曲霉素１μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ组平均集落数分别为１５．３、１６．１个／皿。结论：杂色曲霉素可诱发体外培养的人胚肺细胞发生恶性转化     

人胚虹膜色素上皮细胞的初步培养和鉴定

目的:建立人胚虹膜色素上皮细胞(IPE)分离、纯化培养体系并进行鉴定,为进一步研究IPE提供实验基础.方法:取胎龄为15周左右新鲜水囊引产的人胚眼球,取下虹膜组织,用胰蛋白酶消化,将虹膜色素上皮细胞置于培养瓶中,2周后传代,倒置相差显微镜观察,并取对数生长期细胞分别用透射电镜和扫描电镜检查,用单克隆鼠抗角蛋白抗体(AE1/AE3)标记培养细胞进行鉴定.结果:用胰酶分离消化法,人胚虹膜色素上皮细胞易分离和贴壁.细胞形态与视网膜色素上皮细胞形态极为相似,表现为多边形和梭形两种形态,胞质内含色素颗粒,传代细胞内的色素颗粒比原代细胞的色素颗粒少.免疫细胞化学染色阳性,胞质内见棕黄色染色.结论:人胚虹膜色素上皮细胞分离、纯化的实现为IPE细胞生理功能和IPE移植的深入研究提供了可能.     

组织培养技术的改进 Ⅰ.七种氨基酸培养液对管壁鸡胚单层细胞的培养研究

组织培养技术在病毒学的领域内已有广泛应用。这种技术的成败,取决于组织的选择、营养的要求和各种其他外界因素的影响。近年来发现组织培养的鸡胚细胞可用于Rous氏肉瘤、西方马脑炎、流行性乙型脑炎、新城鸡瘟、腮腺炎、流行性感冒、疱疹、牛痘、兔痘和鼠痘等30种病毒的分离与鑑定。由于鸡胚细胞易于取得、操作简便、生长甚为迅速,故有多采用者,唯用普通的营养液维持期限短促,对某些生长缓慢的病毒在未出现致细胞病变前就产生非特异性脱落,因而不易判定病毒生长繁殖的指标。为了寻求延长对鸡胚细胞的维持期限,我们使用Rappaport氏培养液进行了比较研究。     

不同纯化方法体外培养人胚嗅球嗅鞘细胞

目的 采用不同纯化方法原代培养人胚嗅球嗅鞘细胞(OECs),探讨简单实用可获得高纯度人胚嗅球OECs的体外培养方法.方法 以差速贴壁法为基础结合阿糖胞苷法、无血清饥饿法和问断神经营养因子3(NT3)法纯化培养人胚嗅球OECs.观察不同纯化方法下OECs生长变化,采用免疫细胞化学染色进行纯度鉴定.结果 体外培养的人胚嗅球OECs为双极、三极细胞.细胞突起细长,并可形成细胞突起网络.差速贴壁法培养3～6 d时纯度约为88%,以后成纤维细胞增殖,OECs纯度迅速下降.无血清饥饿法培养3～6 d时OECs纯度约为90%,但细胞状态差.间断NT3法培养3～9 d时OECs纯度约为95%,且细胞状态良好.经统计学处理,第6 d后差速贴壁 间断应用NT2法优于其他方法,细胞纯度的差异有统计学意义(P<0.05).结论 差速贴壁结合同断NT3法可获得高纯度状态良好的OECs,是一种简单实用的OECs纯化培养方法 .     

镉诱导人胚肾细胞损伤分子机理的初步研究

目的：初步探讨镉诱导人胚肾细胞损伤的细胞分子机理。方法：采用MTT法，观察镉对人胚肾细胞损伤的影响；用流式细胞仪检测镉诱导人胚肾细胞凋亡；用分光光度计检测镉对肾细胞SOD活性的影响。结果：几种不同剂量的镉加入细胞作用24h，48h,72h后均能损伤肾细胞，抑制细胞生长；镉能诱导人胚肾细胞凋亡。并且能降低肾细胞SOD活性。结论：镉对人胚肾细胞生长有一定的抑制作用，能诱导人胚肾细胞凋亡及抑制肾细胞SOD活性。     

戊型肝炎病毒在人胚肺二倍体细胞KMB17等传代细胞中的繁殖

目的 探索戊型肝炎病毒（HEV）敏感细胞及体外培养条件。为HEV体外研究提供基础。方法 用戊肝患者急性期阳性粪便悬液感染恒河猴进行毒种的扩增与活化。超速离心处理猴阳性粪便标本获取培养用毒种,将其接种于各种人源性细胞（包括人胚肺二倍体细胞KMB17、人肺癌细胞A549、人肝癌细胞BEL7402、人宫颈癌细胞Hela)和非人灵长类细胞（非洲绿猴肾细胞Vero)。通过细胞病变观察,RT-PCR检测及免疫荧光实验来判定细胞是否对HEV敏感。结果 KMB17、A549、BEL7402细胞中第一代传代7-9d出现细胞病变,11-13d脱落,传至10代仍可经正链和负链RT-PCR检测到HEV基因组正链RNA和复制的负链RNA的存在,而Hela,Vero细胞未见细胞病变,分别于2-4代后经RT-PCR不能扩增到特异片段。在KMB17细胞培养体系中经免疫荧光实验表明实验组有明显荧光着色,病毒捕获RT-PCR扩增到特异片段。结论 在采用的培养条件下,KMB17、A549、BEL7402细胞对HEV敏感,而Hela、Vero细胞不敏感。本研究建立了一定代次内HEV组织培养体系。     

人胚胰岛冷冻保存的实验研究

移植物来源紧张的问题长期以来困扰着胰岛细胞移植的发展 ,对胰岛细胞进行冷冻保存建立细胞库不但可以解决这一问题而且易于控制移植物的质和量 ,为临床移植提供充足的资源和选择性[1] 。本实验对传统冷冻方法[2 ] 进行改良 ,通过优化的六段降温程序冻存人胚胰岛细胞 ,开创性地将玻璃化超快速降温冷冻法应用于对人胚胰岛细胞的冻存。复温后的人胚胰岛在形态及分泌功能上与冷冻前无显著性差别 ,冷冻效果优良。1　材料与方法　　胎龄 18～ 2 8周之间的中期水囊引产死胎 ,胎儿死亡时间不超过 4ｈ ;胎儿无畸形及传染病 (由哈尔滨市各大医院妇产…     

人胚嗅粘膜嗅鞘细胞的分离、培养和纯化

目的 采用经我们改良的差速贴壁法结合神经营养因子3(NT3)和低浓度血清的培养方法对人胚嗅粘膜嗅鞘细胞进行分离和原代纯化培养,探讨建立嗅粘膜嗅鞘细胞体外培养的方法.方法 对差速贴壁后的人胚嗅粘膜嗅鞘细胞交替应用含10%胎牛血清和含2.5%胎牛血清、NT3的DMEM-F12培养基进行原代培养.观察嗅粘膜嗅鞘细胞的形态学变化.采用p75NTR和GFAP免疫细胞化学染色进行鉴定和纯度检测.结果 人胚嗅粘膜嗅鞘细胞形态多呈双极、三极,伴有细长的突起.p75NTR和GFAP染色均呈阳性反应,体外培养9 d时纯度可达83%.结论 差速贴壁法结合低浓度血清和NT3应用可以分离培养出人胚嗅粘膜嗅鞘细胞.     

人胚绒毛提取液对NCI446细胞生长的影响

目的:探讨人胚绒毛提取液对NCI446细胞生长的影响。方法:采用MTT法和平板克隆形成法检测人胚绒毛提取液对NCI446细胞体外生长及干细胞克隆形成的抑制作用。结果:人胚绒毛提取液对NCI446细胞体外生长及干细胞克隆形成均有抑制作用,且随着浓度增加其抑制作用加强,当浓度为1∶10时,NCI446细胞DNA合成抑制率为47.6%,克隆形成抑制率达100%。结论:人胚绒毛组织中存在着某种天然抑瘤物。     

风疹病毒R16株体外感染人胚晶状体上皮细胞的初步研究

目的观察风疹病毒R16株体外感染人胚晶状体上皮细胞的生物学特性。方法利用相差显微镜、透射电子显微镜、免疫细胞化学技术观察风疹病毒R16株在人胚晶状体上皮细胞中的形态学及生长特性。结果风疹病毒R16株体外感染人胚晶状体上皮细胞后,细胞不产生明显的病变效应。受病毒感染的人胚晶状体上皮细胞生长速度较慢,10d后可在细胞质内观察到呈不规则球形、由单层脂质膜包绕、直径60～80nm的病毒颗粒,包括致密核心和无致密核心两种颗粒。而在胞核中未发现病毒颗粒。结论风疹病毒R16株能在人胚晶状体上皮细胞中增殖,为进一步研究风疹病毒感染后先天性白内障的发生机制打下基础。     

人胚嗅粘膜嗅鞘细胞的分禽、培养和纯化

目的采用经我们改良的差速贴壁法结合神经营养因子3（NT3）和低浓度血清的培养方法对人胚嗅粘膜嗅鞘细胞进行分离和原代纯化培养，探讨建立嗅粘膜嗅鞘细胞体外培养的方法。方法对差速贴壁后的人胚嗅粘膜嗅鞘细胞交替应用含10％胎牛血清和含2．5％胎牛血清、NT3的DMEM—F12培养基进行原代培养。观察嗅粘膜嗅鞘细胞的形态学变化．采用p75^NTR和GFAP免疫细胞化学染色进行鉴定和纯度检测。结果人胚嗅粘膜嗅鞘细胞形态多呈双极、三极，伴有细长的突起。p75^NTR和GFAP染色均呈阳性反应，体外培养9d时纯度可达83％。结论差速贴壁法结合低浓度血清和NT3应用可以分离培养出人胚嗅粘膜嗅鞘细胞。     

人胚细胞的体外培养

目的：为医学研究长期提供培养的人胚细胞。方法：体外培养人胚细胞，观察其生长特性、染色体数目以及冻存和复苏的条件。结果：培养的人胚肺、皮肤、肾、脾及脑组织中，肺和皮肤细胞在冻存前后增长速度较快而稳定，染色体数目为２ｎ＝４６，占８７％￣９１％；肾、脾细胞扩增缓慢；脑组织几乎不能扩增。结论：人胚肺和皮肤细胞可长期培养，可为医学研究提供二倍体细胞实验对象。     

化学致癌物对体外培养人胚鼻咽上皮的影响

用化学致癌物甲基硝基亚硝基胍(MNNG)处理人胚鼻咽上皮细胞组织培养物后可见生长曲线发生改变,同时有DNA合成期延长、标记指数增高等细胞动力学参数的变化;并可见非典型性上皮灶、甚至多层次生长。本文对MNNG引起的这些改变作了分析讨论。     

直接植块法构建人胚雪旺细胞人工神经

目的 探索人组织工程神经的构造方法。方法 应用直接植块法将人胚雪旺细胞种植于鼠尾胶包埋的聚羟基乙酸和聚乳酸共聚物支架上，观察细胞在支架上的吸附迁移和生长情况。结果 直接植块法能在较短时间内使人胚雪旺细胞长满支架表面，且保持良好的功能状态。结论 直接植块法是一种实用的构建人组织工程人工神经的方法。     

风疹病毒R16株体外感染人胚晶状体上皮细胞的初步研究

目的观察风疹病毒R16株体外感染人胚晶状体上皮细胞的生物学特性。方法利用相差显微镜、透射电子显微镜、免疫细胞化学技术观察风疹病毒R16株在人胚晶状体上皮细胞中的形态学及生长特性。结果风疹病毒R16株体外感染人胚晶状体上皮细胞后，细胞不产生明显的病变效应。受病毒感染的人胚晶状体上皮细胞生长速度较慢，10d后可在细胞质内观察到呈不规则球形、由单层脂质膜包绕、直径60～80nm的病毒颗粒，包括致密核心和无致密核心两种颗粒。而在胞核中未发现病毒颗粒。结论风疹病毒R16株能在人胚晶状体上皮细胞中增殖，为进一步研究风疹病毒感染后先天性白内障的发生机制打下基础。