三七总皂苷对马兜铃酸I诱导的人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的：探讨三七总皂苷（total saponins of panax notoginseng, PNS）对马兜铃酸I（aristolochic acid I,AAI）诱导的人肾小管上皮细胞株HK-2转分化的影响。方法：应用倒置相差显微镜观察HK-2细胞形态学变化；免疫组织化学方法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）的表达；ELISA法测定培养细胞上清液中转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）的含量。结果：AA I诱导组HK-2细胞从原有典型的上皮细胞形态转变为长梭形肌成纤维细胞形态；胞浆内大量表达α-SMA，其积分光密度值增加（P<0.05）；细胞培养上清液中TGF-β1含量均增加，且呈时间依赖性（P<0.05）。不同剂量PNS治疗可减轻AA I诱导的细胞形态学改变，不同程度的抑制α-SMA的表达和TGF-β1的分泌，且呈剂量依赖性（P<0.05）。PNS对照组HK-2细胞形态学、α-SMA表达和TGF-β1分泌与空白对照组比较均无明显变化。结论：AA I可通过促进TGF-β1的分泌诱导肾小管上皮细胞转分化，促进细胞外基质α-SMA的合成；PNS可抑制AA I诱导的肾小管上皮细胞转分化作用，减少α-SMA的表达，该作用可能是通过抑制TGF-β1表达实现的。     

甲状旁腺素对人肾小管上皮细胞转分化和TGF-β1表达的影响

目的:通过观察甲状旁腺素(PIH)对体外培养的人肾小管上皮细胞转分化和转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的影响,以探讨PTH在肾间质纤维化发病机制中的作用.方法:体外培养人近端肾小管上皮细胞(HK-2),分别用不同浓度的PTH(10-12、10-11、10-10、10-9、10-8 mol/L)作用于HK-2细胞48 h,以及10-8 mol /L作用于HK-2细胞不同时间(12、24、48、72 h).应用RT-PCR法检测HK-2细胞内α-SMA、TGF-β1 mRNA表达水平,免疫细胞化学法检测HK-2细胞表达α-SMA阳性细胞百分数,Western blot法检测细胞内α-SMA的蛋白表达水平.结果:(1)RT-PCR结果表明,PTH呈剂量和时间依赖性地促进HK-2细胞α-SMA、TGF-β1 mRNA的表达(P＜0.01),且两者之间呈正相关(P＜0.05).(2)免疫细胞化学结果表明,PTH可增加表达α-SMA阳性的HK-2细胞百分数,且呈剂量和时间依赖性(P＜0.05).(3)Western blot结果表明,PTH 可增加HK-2细胞α-SMA的蛋白表达量,也呈剂量和时间依赖性(P＜0.01).结论:PTH可通过促进肾小管上皮细胞转分化以及TGF-β1的表达促进肾小管间质纤维化.     

脂多糖对人近端肾小管上皮细胞IL-18及其受体复合物表达的影响

观察脂多糖(LPS)对体外培养人近端肾小管上皮细胞IL-18及其受体表达的影响,以初步探讨IL-18在肾小管-间质炎症损伤过程中的作用。以不同浓度LPS(0.01、0.1、1、5、10μg/ml)处理人近端肾小管上皮细胞株(HK-2)24 h、36 h及48 h,然后应用RT-PCR及ELISA测定IL-18及其受体α链(IL-18Rα)和β链(IL-18Rβ)mRNA及蛋白的表达水平变化。静息培养的HK-2细胞表达IL-18 m RNA和蛋白、IL-18Rα和IL-18Rβm RNA,LPS促进HK-2细胞IL-18 mRNA和蛋白的表达及IL-18Rα和IL-18RβmRNA的表达,并呈剂量和时间依赖趋势。肾小管上皮细胞可能既是IL-18的产生者,又是IL-18的靶细胞之一,炎症状态下肾小管上皮细胞通过IL-18自分泌方式参与肾小管-间质的炎症损伤过程。     

三七总皂苷对马兜铃酸Ⅰ诱导的人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的:探讨三七总皂苷(total saponins of panax notoginseng,PNS)对马兜铃酸Ⅰ(aristolochic acid Ⅰ,AAI)诱导的人肾小管上皮细胞株HK-2转分化的影响.方法:应用倒置相差显微镜观察HK-2细胞形态学变化;免疫组织化学方法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,a-SMA)的表达;ELISA法测定培养细胞上清液中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的含量.结果:AA I诱导组HK-2细胞从原有典型的上皮细胞形态转变为长梭形肌成纤维细胞形态;胞浆内大量表达α-SMA,其积分光密度值增加(P<0.05);细胞培养上清液中TGF-β1含量均增加,且呈时间依赖性(P<0.05).不同剂量PNS治疗可减轻从Ⅰ诱导的细胞形态学改变,不同程度的抑制α-SMA的表达和TGF-β1的分泌,且呈剂量依赖性(P<0.05).PNS对照组HK-2细胞形态学、α-SMA表达和TGF-β1分泌与空白对照组比较均无明显变化.结论:AA I可通过促进TGF-β1的分泌诱导肾小管上皮细胞转分化,促进细胞外基质α-SMA的合成;PNS可抑制AA I诱导的肾小管上皮细胞转分化作用,减少α-SMA的表达,该作用可能是通过抑制TGF-β1表达实现的.     

激活法尼酯X受体上调核心蛋白聚糖表达对肾小管上皮细胞转分化的作用

目的研究激活法尼酯X受体(FXR)对核心蛋白聚糖(decorin)表达的变化及其对肾小管上皮细胞-间充质转分化的影响。方法 (1)采用不同浓度的FXR特异性激动剂CDCA及拮抗剂Guggulsterones处理肾小管上皮细胞(HK-2),观察decorin的mRNA和蛋白表达的变化;(2)将HK-2细胞分为对照组,TGF-β1诱导组(20 ng/ml),TGF-β1诱导加CDCA组(100μmol/L)和TGF-β1诱导加CDCA、Guggulsterones共处理组,48 h后观察各组细胞的形态变化,检测各组decorin、E-cadherin和α-SMA的mRNA和蛋白表达的情况。结果 (1)CDCA激活HK-2细胞FXR,decorin的mRNA和蛋白表达升高,且呈剂量依赖。在100μmol/L CDCA和不同浓度Guggulsterones共处理HK-2细胞,随着Guggulsterones浓度升高,decorin的mRNA和蛋白表达逐渐减低;(2)RT-PCR和Western blot显示,decorin在对照组、TGF-β1组无表达,在TGF-β1+CDCA组明显上调(与TGF-β1组比,P<0.05),在TGF-β1+CDCA+Guggulsterones组表达显著下降;E-cadherin在对照组高表达,在TGF-β1组显著下调,在TGF-β1+CDCA组显著上调(与TGF-β1组比,P<0.05),在TGF-β1+CDCA+Guggulsterones组表达显著下降;α-SMA在对照组无表达,在TGF-β1组显著上调,在TGF-β1+CDCA组显著下调(与TGF-β1组比,P<0.05),在TGF-β1+CDCA+Guggulsterones组表达显著上调。结论 CDCA激活肾小管上皮细胞FXR能够通过上调decorin的表达,从而抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞-间充质转分化。     

蟾蜍灵抑制TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞-间充质细胞系转换

目的探讨蟾蜍灵对转化生长因子(TGF)-β1诱导的人肾小管上皮细胞-间充质细胞转换的影响。方法将体外培养的人近端肾小管上皮细胞系(HK-2)细胞分为3组:1)对照组;2)TGF-β1组:在细胞培养基中加入TGF-β1(浓度为5μg/L);3)蟾蜍灵+TGF-β1组:在细胞培养基中分别加入蟾蜍灵和TGF-β1(浓度为5μg/L),按蟾蜍灵的浓度分为A、B、C 3个亚组:分别为1×10~(-9)、1×10~(-8)和1×10~(-7)mol/L。72 h后,用倒置相差显微镜观察细胞形态;用实时定量PCR、蛋白印迹法和免疫荧光检测细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达。结果 TGF-β1组HK-2细胞从原有典型的铺路石样上皮细胞转变为长梭形肌成纤维细胞;胞质内大量表达α-SMA,同时E-cadherin的表达明显减少(P0.01);蟾蜍灵处理后TGF-β1诱导的细胞形态学改变减轻,胞质内α-SMA的表达减少(P0.05),同时E-cadherin的表达明显恢复,且呈剂量依赖性。结论蟾蜍灵能有效抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞转换,对肾脏病治疗具有潜在应用前景。     

1,25（OH）2D3对甲状旁腺素诱导的肾小管上皮细胞转分化和TGF-β1的表达的影响

目的:探讨1,25(OH)2D3对甲状旁腺素(PTH)诱导的肾小管上皮细胞转分化和转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的影响。方法:人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)培养在含50 mL/L FCS的DMEM/F12培养液中。对照组:加入等体积含50 mL/L FCS的DMEM/F12培养液;PTH刺激组:加入终浓度为10-10 mol/L PTH的含50 mL/L FCS的DMEM/F12培养液;PTH+1,25(OH)2D3干预组:加入10-10 mol/L PTH,同时加入不同浓度(10-10、10-9、10-8、10-7 mol/L)的1,25(OH)2D3。刺激HK-2细胞48 h。半定量RT-PCR法检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和TGF-β1的基因表达;Western blot法检测细胞中α-SMA和TGF-β1的蛋白表达;免疫细胞化学法检测细胞中α-SMA的表达;ELISA法检测细胞培养上清液中TGF-β1的含量。结果:半定量RT-PCR结果显示,对照组HK-2细胞中几乎无α-SMA的mRNA表达,仅有少量的TGF-β1 mRNA表达;PTH刺激组α-SMA和TGF-β1mRNA表达量与对照组比较明显增加;PTH+1,25(OH)2D3干预组表达量比PTH刺激组显著降低,且随着1,25(OH)2D3浓度的升高呈一定的剂量依赖性(P<0.05)。Western blot结果显示,对照组HK-2细胞中无α-SMA的蛋白表达,仅有少量的TGF-β1蛋白表达;10-10 mol/L的PTH能够明显诱导HK-2细胞中α-SMA的蛋白表达,增加TGF-β1的蛋白表达量;PTH+1,25(OH)2D3干预组,α-SMA和TGF-β1的蛋白表达量比PTH刺激组显著降低(P<0.05)。免疫细胞化学法结果显示,对照组几乎无α-SMA阳性表达的细胞,PTH刺激组可见大量细胞α-SMA表达阳性;PTH+1,25(OH)2D3干预组α-SMA表达阳性的细胞数明显低于PTH刺激组(P<0.05)。ELISA结果显示,对照组细胞上清液中可检测到少量的TGF-β1,PTH刺激组含量显著升高,PTH+1,25(OH)2D3干预组与PTH刺激组比较含量明显降低(P<0.05)。结论:1,25(OH)2D3能够部分拮抗PTH诱导的HK-2细胞转分化和TGF-β1的表达。     

Notch1在TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化中的表达和意义

目的:探讨Notch1蛋白及其mRNA在TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化(KTECT)中的动态表达及意义.方法:以体外培养的人近端肾小管上皮细胞株( HK-2)为研究对象,实验分为空白对照组及TGF-β1( 10 ng/mL)诱导组.加入TGF-β1作用后分别于12 h、24h、48 h及72 h在倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化;用细胞免疫组化染色法检测α-平滑肌肌动蛋白( α-SMA)、E-钙黏连素(E-cadherin)和Notch1蛋白表达的变化;用RT-PCR法检测α-SMA mRNA、Ecadherin mRNA和Notch1 mRNA表达的变化.结果:与空白对照组相比较,在加入TGF-β1作用后12 h、24h、48 h及72h,TGF-β1诱导组α-SMA蛋白及其mRNA表达明显增加(P＜0 05);Notch1蛋白及其mRNA在TGF-β1作用后的24h、48h、72 h表达逐渐增加(P＜0.05);E-cadherin蛋白及其mRNA表达在24h、48 h、72 h明显减少(P＜0.05);Notch1蛋白及其mRNA的表达与E-cadherin蛋白及其mRNA的表达呈负相关(r蛋白=-0.937;rmRNA=-0.921;假设检验结果(P＜0.05),与α-SMA蛋白及其mRNA的表达呈正相关(r蛋白=0.958;rmRNA=0.944;假设检验结果(P＜0.05).结论:Notch1极有可能参与了TGF-β1诱导的KTECT.     

结缔组织生长因子在转化生长因子β诱导的肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的：探讨结缔组织生长因子（CTGF）在转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的肾小管上皮细胞表型转化中的可能作用。方法： 将NRK52E肾小管上皮细胞分组处理，光镜、扫描电镜、透射电镜观察细胞形态的改变，细胞免疫组化检测ɑ-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和细胞角蛋白-18的表达，RT-PCR和Western blot检测Ⅰ型胶原的表达。 结果：TGF-β1 10 μg/L作用3 d，NRK52E小管上皮细胞失去正常的椭圆形，变得肥大，胞体拉长，扫描电镜下，见成纤维细胞状，失去上皮细胞特有的顶端-基底极性和表面的微绒毛结构，透射电镜下胞浆中见到微丝和致密体结构，骨架标志上肾小管上皮细胞较具特征性的细胞角蛋白-18表达减少,肌成纤维细胞标志性的α-SMA表达增多，Ⅰ型胶原分泌增多；加入TGF-β1中和抗体和CTGF反义寡核苷酸可以大部分阻断TGF-β的作用，而正义的CTGF寡核苷酸不能阻断TGF-β的作用。 结论： NRK52E细胞中，CTGF作为TGF-β的下游效应因子，介导了TGF-β诱导的肾小管上皮细胞转分化。     

白细胞介素-34/集落刺激因子-1R在转化生长因子-β1诱导A549细胞上皮-间质转化中的表达

目的探讨白细胞介素-34/集落刺激因子-1受体(IL-34/CSF-1R)在转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导A549细胞发生上皮-间质转化(EMT)中的表达。方法体外培养A549细胞;CCK 8法检测不同浓度TGF-β1在不同时间点对A549细胞增殖的影响;选用5μg/L TGF-β1刺激A549细胞(0、12、24、48h),提取细胞蛋白和RNA,Western blotting法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏连蛋白(E-Cad)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)蛋白的变化;Real-time PCR法检测IL-34、CSF-1R、MMP-2、MMP-9基因表达的变化。结果 TGF-β1对A549细胞的增殖无明显影响(P0.05)。TGF-β1刺激A549细胞后,间质细胞标志性蛋白α-SMA表达升高,上皮细胞标志性蛋白E-Cad表达下降,纤维化相关的MMP-2蛋白表达升高,MMP-9蛋白表达先升高后下降,TIMP-1蛋白早期出现短暂性增高后,呈持续降低趋势(P0.01)。IL-34mRNA表达逐渐升高,CSF-1R mRNA、MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表达先升高后下降(P0.01)。结论 TGF-β1诱导A549细胞的EMT过程中,存在IL-34/CSF-1R的动态表达。