CD46 RNAi对CD59介导的T细胞信号转导的作用研究

目的构建携带针对CD46基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体,研究糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白CD59与CD46在介导T细胞信号转导中的相关性。方法将能转录产生靶向CD46小发夹RNA(shRNA)的寡核苷酸序列,克隆入逆转录病毒载体pSUPER retro,转化大肠杆菌JM109并转染Jurkat细胞。将Jurkat细胞分为未转染的Jurkat细胞组(Ⅰ组)、转染空质粒的Jurkat细胞组(Ⅱ组)、转染CD59干扰质粒的Jurkat细胞组(Ⅲ组)及转染CD46干扰质粒的Jurkat细胞组(Ⅳ组)。用RT-PCR、Western blot技术检测各组细胞中的CD59、CD46基因的表达水平。用噻唑蓝(MTT)比色法检测CD46与CD59联合作用对4组Jurkat细胞的增殖效应。结果重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后送测序,结果表明序列正确,构建成功,稳定转染后,Ⅳ组细胞CD46分子的表达被成功抑制,Ⅲ组细胞CD59分子的表达被抑制。Ⅰ组和Ⅱ组细胞CD46与CD59单抗联合作用后,增殖能力明显高于Ⅲ组、Ⅳ组(P<0.05);但Ⅰ组和Ⅱ组,Ⅲ组和Ⅳ组之间无差异。结论 CD59可增强CD46对T细胞信号转导的效应。     

携带钙整合素结合蛋白基因逆转录病毒表达载体的构建及包装细胞系的建立

目的:构建钙整合素结合蛋白(CIB)的逆转录病毒表达载体,并建立包装细胞系.方法:质粒pet32-CIB经EcoR I和Xho I双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建重组逆转录病毒表达载体pLXSN-CIB,PCR及双酶切鉴定后,通过脂质体转染导入包装细胞pA317,G418稳定筛选后获得抗性克隆,NIH3T3细胞进行逆转录病毒颗粒谪度测定.结果:重组逆转录病毒表达载体pLXSN-CIB质粒测序结果与GenBank中序列一致,经PCR及酶切鉴定证实,获得了大约574 bp的基因片段,且正确插入pLXSN-CIB载体中；建立了pA317-CIB包装细胞系,采用NIH3T3细胞测定病毒滴度为6.81 ×105 CFU/mL.结论:pLXSN-CIB结构正确,成功构建了CIB基因的逆转录病毒表达载体并建立了pLXSN-CIB包装细胞系.     

胰岛素样生长因子-1基因真核表达载体的构建

目的构建胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因重组逆转录病毒,为将IGF-1基因应用于神经系统疾病的治疗打下基础。方法质粒pcDNA3.1-IGF-1经EcoR I和Xho I双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建成重组逆转录病毒表达载体pLXSN-IGF-1,采用酶切及测序对重组体进行鉴定。而后脂质体转染pLXSN-IGF-1至包装细胞pA317,检测培养上清病毒滴度。结果重组真核基因表达载体pLXSN-IGF-1经EcoR I和Xho I双酶切后,得到了400 bp和6.0 kb两条带;以重组体为模板进行PCR检测,400 bp的目的基因片段呈阳性;重组体测序结果与预期结果完全一致;建立了细胞系PA317-IGF-1,其培养上清平均病毒滴度为6.5×105CFU/ml。结论成功构建了IGF-1基因重组逆转录病毒。     

hTrx基因重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的 :构建携带人Trx(硫氧还蛋白 )基因的逆转录病毒载体。方法 :用DNA重组技术 ,将人Trx基因定向克隆入逆转录病毒载体pLXSN ,用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ进行酶切鉴定。以磷酸钙转染法 ,将重组的逆转录病毒载体转染入包装细胞系PA317,并用G4 18筛选的方法测定转染细胞上清中病毒的滴度。结果 :构建了重组逆转录病毒载体 ,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切 ,电泳出现两个条带 ,分别为 0 .3kb和 5 .9kb。转染细胞上清中病毒滴度为 5 .5× 10 9cfu/L。提示构建携带人Trx基因的逆转录载体成功。结论 :携带人Trx基因的逆转录病毒载体成功构建为Trx基因的治疗、实验研究奠定了基础     

GDNF基因逆转录病毒表达载体的构建及转染神经干细胞的研究

应用基因重组技术将大鼠GDNF cDNA克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,经酶切及PCR对重组质粒进行鉴定.将重组体包装到PA317细胞中,并感染增殖旺盛的大鼠神经干细胞,通过免疫细胞化学、RT-PCR和western-blot等方法鉴定转染效率.结果显示GDNF cDNA正确地克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,该真核细胞表达载体成功转染增殖旺盛的神经干细胞并有效表达.因此本研究成功构建了GDNF真核细胞表达载体,并成功转染到神经干细胞中.为移植替代和基因治疗神经系统疾病提供了实验基础.     

逆转录病毒载体介导的RNAi技术抑制HeLa细胞CD59表达及功能的研究

目的构建针对CD59基因的RNAi逆转录病毒载体并感染HeLa细胞,观察CD59基因抑制后对补体溶破的抵抗作用的变化。方法应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,构建3条含特异性CD59基因的重组载体,并以无关序列作为对照,脂质体法转染包装细胞并感染HeLa细胞,RT-PCR和ELISA检测靶细胞上CD59基因的抑制效果,染料释放试验检测CD59功能的改变。结果重组载体经鉴定正确,转染包装细胞成功,RT-PCR和ELISA结果显示能显著抑制CD59基因的表达,染料释放试验显示干扰组对补体溶破的抵抗作用降低。结论特异性沉默CD59基因的逆转录病毒载体构建和筛选成功,并能抑制CD59基因的表达及减弱CD59对补体的抑制功能,为后续进行肿瘤细胞的研究奠定了基础,可望为肿瘤的免疫治疗开辟新途径。     

三种反义c-myc逆转录病毒表达载体的纯化、病毒包装、滴度测定及整合检测

为了增强逆转录病毒构建体对靶细胞的转染能力 ,本实验使用 Wizard TMDNA纯化系统对构建成功的三种反义 c- myc逆转录病毒表达载体进行了纯化 ,并经脂质体介导包装 PA317细胞 ,使用 NIH 3T3细胞测定了 PA317抗性细胞克隆的病毒滴度 ,用 neo基因 PCR扩增检测外源基因的整合情况。结果显示纯化后的DNA达到了真核细胞转染的要求 ,但其包装滴度的高低还受靶细胞生长状态、 PA317抽样量的高度影响 ,而neo基因 PCR检测是一种敏感、经济和可靠的基因整合检测法     

CD59真核表达载体的构建及其对Jurkat细胞增殖的影响

目的构建pIRES-CD59融合基因真核表达载体,探讨重组CD59在Jurkat细胞增殖中的作用。方法 RT-PCR法选择性扩增编码CD59的基因片段,克隆入pIRES真核表达质粒。脂质体法将重组载体转染Jurkat细胞,通过G418筛选获得稳定表达CD59的细胞克隆,利用RT-PCR和Western blot检测细胞中CD59的表达,通过MTT法检测Jurkat细胞的增殖。结果经酶切和测序鉴定表明携带CD59基因的重组质粒构建成功,RT-PCR和Western blot结果显示转染Jurkat细胞的CD59基因高表达,MTT实验显示转染CD59重组质粒的Jurkat细胞增殖速度明显快于对照组(P<0.05)。结论 pIRES-CD59真核表达载体在转染细胞Jurkat中可高表达CD59分子,并可影响Jurkat细胞的增殖,为研究CD59的生物学作用奠定了基础。     

CD147 shRNA质粒表达载体的构建及鉴定

目的构建表达细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(CD147,EMMPRIN)基因序列特异性的短发夹样RNA(short hairpin RNA,shRNA)载体。方法根据CD147基因序列及shRNA设计原则,化学合成两段编码短发夹RNA寡核苷酸序列,将其定向克隆到pGenesil-1.1质粒表达载体中,重组构建RNAi质粒,并对重组质粒进行酶切分析。结果限制性内切酶Eco31I和SacI酶切显示设计合成的shRNA编码序列被成功插入pGenesil-1.1质粒载体中,酶切结果证实插入片段与设计序列完全一致,成功构建针对基因CD147的shRNA质粒表达载体。结论成功构建人CD147基因重组载体,为研究CD147蛋白的生物学效应和骨肉瘤的治疗提供实验依据。     

下调Cbp分子促进GPI锚固蛋白CD59参与T细胞活化

目的采用RNA干扰技术构建针对Cbp基因的pSUPER-siCbp重组载体,以建立其高效转染表达体系。方法设计针对Cbp基因的寡核苷酸序列,克隆至线性化的pSUPER载体中并进行鉴定。采用电转染方法转染Jurkat细胞,荧光显微镜观察GFP基因表达,并行RT-PCR和Western blot检测转染细胞中Cbp的表达。利用噻唑蓝(MTT)比色法检测转染重组载体前后各组Jurkat细胞的增殖效应;应用ELISA检测细胞上清中白介素2(IL-2)的变化水平,比较各组差异。结果经过限制性内切酶双酶切分析、DNA PCR和DNA测序鉴定,证实重组质粒pSUPER-siCbp的序列正确。转染重组质粒的Jurkat细胞,可表达绿色荧光蛋白,转染J2-pSUPER-siCbp重组质粒的Jurkat细胞中Cbp基因表达量明显低于其他各组;其细胞增殖能力,IL-2分泌高于其他各组。结论成功构建了靶向人Cbp基因的pSUPER-siCbp载体,转染Jurkat细胞中Cbp表达降低,为以后的CD59与Cbp在T细胞信号转导通路中相互作用研究奠定了基础。     

siRNA介导的RNAi降低了CD59对补体溶破的抵抗作用

目的:构建针对人CD59基因的siRNA表达载体并筛选稳定细胞系,观察CD59基因改变后对补体溶破的抵抗作用的变化,探讨CD59在肿瘤细胞免疫逃逸及相关信号转导通路中的作用。方法:应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,构建含特异性CD59基因的重组载体,脂质体法转染A2780细胞,G418筛选建立稳定抑制的细胞克隆,RT-PCR和Western blot检测转染细胞中CD59基因的表达抑制效果,染料释放试验判断CD59基因抑制后对补体溶破的抵抗作用的影响。结果:重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后送测序,结果表明序列正确;重组载体转染A2780细胞,可表达绿色荧光蛋白,经G418筛选,得到抗性细胞克隆,RT-PCR和Western blot表明,稳定转染后CD59基因的mRNA和蛋白水平降低,染料释放试验表明CD59基因受抑制后对补体溶破的抵抗作用降低。结论:特异性沉默CD59基因的siRNA表达载体以及稳定抑制的细胞系构建和筛选成功,CD59基因抑制后对补体溶破的抵抗作用降低,为后续进行肿瘤细胞的研究奠定了基础。     

突变人CD59基因真核表达系统的构建

目的：构建2种突变人CD59(HMCD59)重组质粒，建立高效真核表达系统。方法：采用基因点突变技术在CD59易于糖基化的位点K41-H44将H44基因位置变更或增加K的数目，构建2种不同的CD59突变基因，各设计两条互补突变引物和两条常规引物，以已构建CD59 cDNA为模板，3重PCR定点诱变扩增突变基因，EcoR Ⅰ酶切重组人真核表达质粒载体pALTER-MAX，利用阳离子脂质体(Lipfectamine-2000)将重组质粒和pcDNA3共转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary，CHO)进行表达。结果：通过PCR定点诱变成功获得目的CD59突变基因，序列测定及酶切鉴定均证实成功构建了pALTERMAX-突变CD59重组真核表达载体系统，突变基因长度约500bp。阳离子脂质体(Lipfectamine-2000)将重组载体质粒和pcDNA3共转染导入真核受体细胞(CHO)，C418筛选出了稳定细胞克隆。结论：以突变CD59基因和pALTER-MAX质粒为基础构建的真核表达载体构建成功，脂质体转染法将重组质粒导入真核细胞并获得膜表面突变CD59分子的高效表达。     

肿瘤凋亡相关分子CD59突变体的构建及作用研究

目的 构建CD59第40位氨基酸突变的重组体,研究Hela细胞中CD59基因突变引起肿瘤逃逸相关分子caspase-3表达量的变化.方法 采用重组聚合酶链反应定点诱变技术构建第40位氨基酸突变的CD59,克隆入pALTER-MAX质粒,采用阳离子脂质体法将重组质粒转染Hela细胞.G418筛选稳定表达细胞克隆,免疫酶标、免疫荧光、ELISA筛选出高表达CD59的细胞株,用免疫组化法检测转染前后Hela细胞内caspase-3表达量的变化.结果 ①酶切鉴定和序列测定均证实成功构建了CDJ9第40位氨基酸突变的重组质粒.②转染突变CD59后Hela细胞内caspase-3的表达明显增加,与未转染的Hela细胞比较(P<0.01)差别有显著差异.结论 caspase-3的表达变化可能是CD59引起肿瘤逃逸的另一途径.     

HBsAg逆转录病毒表达质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的构建乙型肝炎表面抗原(HBsAg)逆转录病毒表达质粒并探讨其在真核细胞中的表达.方法用限制性内切酶从重组质粒pBKS-S中切出HBsAg基因,并亚克隆到逆转录病毒表达质粒pLXSN,构建成重组质粒pLXSN-S;经限制性内切酶消化和DNA序列测定鉴定无误后,用阳离子脂质体转染法将重组质粒pLXSN-S分别转染HepG2、K562和EB病毒转化B淋巴母细胞(EBVC);用ELISA法检测HBsAg在细胞培养上清中的表达.结果经酶切和DNA序列测定鉴定证实重组质粒构建正确;质粒pLXSN-S转染细胞培养上清均可检测到HBsAg.结论逆转录病毒表达质粒pLXSN-S构建成功并可在真核细胞中稳定表达.     

NT-3基因逆转录病毒表达载体的构建

目的:分离大鼠神经营养素-3(NT-3)基因, 构建pLEGFP-NT3逆转录病毒表达载体.方法:利用RT-PCR技术钓取大鼠NT-3基因, 克隆到测序载体pMD18-T中, 测序后再亚克隆到逆转录病毒载体pLEGFP-C1中, 通过Lipofectamine 2000导入包装细胞PA317.结果:RT-PCR产物为776 bp, 经测序鉴定虽与GenBank中NT-3基因的序列相差1个碱基, 但不影响NT-3蛋白质的表达;构建的pLEGFP-NT3重组载体经酶切鉴定,证实NT-3基因片段正确插入pLEGFP-C1载体中.转染包装细胞后, 激光共聚焦显微镜下观察导入NT-3基因的PA317细胞发绿色荧光.结论:分离得到了大鼠NT-3基因成功构建了pLEGFP-NT3表达载体.     

人RUVBL2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建带有绿色荧光蛋白的RUVBL2真核表达载体pEGFP-N1-RUVBL2,并鉴定其在HeLa细胞中的表达。方法:以pGADT7-RUVBL2质粒为模板,PCR扩增RUVBL2基因,首先克隆至T载体中,进一步亚克隆至p-EGFP-N1,并对重组表达载体进行酶切及测序鉴定。采用脂质体转染法将重组质粒瞬时转染HeLa细胞系,应用荧光显微镜观察绿色荧光融合蛋白的表达,并用Western blot法检测RUVBL2-GFP融合蛋白的表达。结果:经限制性酶切鉴定及测序分析证实pEGFP-N1-RUVBL2载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的HeLa细胞中有绿色荧光蛋白的表达,Western blot法证实转染细胞中能表达RUVBL2-GFP融合蛋白。结论:pEGFP-N1-RU-VBL2表达载体构建成功,并在HeLa细胞内成功表达。     

DOC-1R基因重组表达载体构建及其在HeLa细胞中的表达

目的 构建人DOC-1R基因重组逆转录病毒表达载体,实现该基因在体外培养细胞中的大量表达,从而研究表达蛋白的功能。方法 通过重组技术将含有FLAG标签序列的DOC-1R cDNA编码区全长克隆至逆转录病毒载体pLXSN,菌落PCR鉴定、限制性内切酶双酶切及测序验证重组载体的构建。将重组载体转染至GP-293细胞进行病毒包装并以所包装的病毒感染HeLa细胞,通过Western blot及间接免疫荧光染色检测重组DOC-1R蛋白的表达及细胞内定位。结果 测序结果表明重组载体中插入的重组片段序列及开放阅读框架正确,逆转录病毒表达载体pLXSN-FLAG-DOC-1R成功构建。Western blot及间接免疫荧光染色结果证实,逆转录病毒介导的重组DOC-1R蛋白在HeLa细胞中高效表达,表达效率明显高于真核表达载体介导的重组蛋白表达。结论 DOC-1R基因逆转录病毒表达载体成功构建,重组蛋白在体外培养细胞正确高效表达。     

逆转录病毒载体介导的HSVtk基因表达及提高重组逆转录病毒滴度的研究

目的 探讨逆转录病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)基因表达及提高逆转录病毒滴度的措施。方法 将HSVtk基因插入逆转录病毒载体pRevTRE中,构建重组逆转录病毒载体。通过微乒乓感染法导入包装细胞PA317中,以潮霉素B筛选克隆细胞,浓缩克隆细胞上清制备重组逆转录病毒。在不同时间及不同丁酸钠浓度下,检测分析经筛选获得阳性克隆靶细胞中有无HSVtk基因的表达及如何获得高滴度的重组病毒液。结果 成功构建了重组逆转录病毒载体RevTRE／tk,制备的重组病毒感染靶细胞后有HSVtk基因的表达。结论 通过微乒乓感染法在包装细胞PA317培养30h和10mmol／L丁酸钠浓度下,经冷冻超速离心能获得携HSVtk基因的高滴度逆转录病毒颗粒,为其基因治疗的应用及研究奠定了基础。     

反义HLA-A2和GDNF共表达逆转录病毒载体的构建和鉴定

为构建GDNF和反义HLA -A2共表达的逆转录病毒载体,将人GDNF酶切片段(XhoI/SalI)克隆于逆转录病毒载体pLNCX2 的XhoI位点,再将HLA A2cDNA片段反向克隆于上述重组载体的HindIII/SalI位点,对其作酶切鉴定和测序后转染PA317包装细胞系进行病毒的包装。收获重组病毒感染的NIH3T3并进行病毒滴度的测定,GDNF及HLA- A2表达的RT -PCR检测,进一步感染人胚肺成纤维细胞,观察GDNF分泌情况。结果表明:GDNF和反义HLA -A2两片段的序列和插入方向完全正确,包装后获得的重组病毒的平均滴度为5×105 CFU/ml。RT PCR显示:在小鼠源性的PA317细胞中有人GDNF和HLA A2的表达,ELISA法测得病毒感染人胚肺成纤维细胞上清液中GDNF含量为450pg/ml。通过本实验,我们获得能共表达GDNF和反义HLA -A2的重组逆转录病毒,其转染的人成纤维细胞具有合成GDNF的能力。     

HBsAg逆转录病毒表达质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的 构建乙型肝炎表面抗原(HBsAg)逆转录病毒表达质粒并探讨其在真核细胞中的表达。方法 用限制性内切酶从重组质粒pBKS—S中切出HBsAg基因，并亚克隆到逆转录病毒表达质粒pLXSN，构建成重组质粒pLXSN—S；经限制性内切酶消化和DNA序列测定鉴定无误后，用阳离子脂质体转染法将重组质粒pLXSN—S分别转染HepG2、K562和EB病毒转化B淋巴母细胞(EBVC)；用ELISA法检测HBsAg在细胞培养上清中的表达。结果 经酶切和DNA序列测定鉴定证实重组质粒构建正确；质粒pLXSN—S转染细胞培养上清均可检测到HBsAg。结论 逆转录病毒表达质粒pLXSN—S构建成功并可在真核细胞中稳定表达。