来自光裸方格星虫产纤溶酶蜡状芽孢杆菌的鉴定

对广西北部湾光裸方格星虫中产纤溶酶菌株进行筛选和鉴定,结合脱脂乳平板与纤维蛋白板筛选出产纤溶酶菌株,并对其粗酶液的血栓溶解机制进行了体外初步研究。结果显示,从光裸方格星虫获得5株产纤溶酶菌株,其中GXUSP-1菌株纤溶酶粗酶活力(相当尿激酶酶活力单位)为303.2 U/mL,经初步鉴定该菌为蜡状芽孢杆菌属,属于海洋共生菌,该菌株粗酶液能通过直接和间接两种方式溶解血栓,且体外溶解血栓作用显著。GXUSP-1具有良好的潜在工业应用价值。     

一株产纤溶酶菌株的分离、鉴定及其酶活特征的初步研究

[目的]分离筛选并鉴定产纤溶酶的菌株.[方法]采用血粉培养基富集,琼脂糖-纤维蛋白平板筛选,从自然界中分离筛选出一株产纤溶活性物质的菌株.通过形态学特征、生理生化特征研究,并结合16S rRNA基因序列分析及分子系统发育树的构建结果,确定菌株的种类.[结果]从自然界分离筛到一株产纤溶酶的菌株EF608,经鉴定该菌株为粪肠球菌(Enterococcus faecalis). SDS-PAGE和纤维蛋白自显影表明该纤溶酶的分子量为37 kD,最适反应温度和pH分别为35℃和7.5,EDTA能完全抑制其纤溶活性,而PMSF对其活性无抑制作用.菌株EF608发酵液不仅可以直接水解纤维蛋白,而且具有体外溶栓的作用,对血红细胞没有溶解作用.[结论]筛选到一株具有纤溶活性的粪肠球菌——EF608,为获取新型纤溶酶提供了一种的新的菌源.     

一株产纤溶酶菌株的分离鉴定及其纤溶组分分析

【目的】筛选性能良好的产纤溶酶菌株,对菌株进行多项分类鉴定,分析其纤溶酶系的组成特征及纤溶能力。【方法】通过酪蛋白培养基初筛,琼脂-纤维蛋白双层平板复筛,从海泥、土壤等环境中筛选纤维蛋白降解菌,以尿激酶为标准测定纤溶酶活性。通过形态学、生理生化特征研究,结合16S rDNA基因序列分析菌株种类及系统分类地位。通过SDS-PAGE和纤维蛋白酶谱法分析胞外纤溶酶系的组成特征。【结果】筛选到一株能降解纤维蛋白的细菌CNY16,鉴定其为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)。该酶为胞外酶,SDS-PAGE和纤维蛋白酶谱结果表明该纤溶酶系有至少两种分子量大小不同的纤溶酶,分别约33 kD和23 kD。能有效溶解血块中纤维蛋白,并且对红细胞无降解作用。【结论】细菌CNY16是一株新的纤溶酶产生菌,纤溶酶活性及稳定性较好,具有潜在开发价值。为获取新型纤溶酶提供了一种新的菌源。     

豆豉纤溶酶高产菌株的筛选研究

以中国豆豉为材料,取6个不同来源的样品经富集培养后,用自制血纤维蛋白平板进行初筛;利用LB纤维蛋白平板复筛与血琼脂平板进行体外溶血试验相结合的方法,筛选出安全性良好并有一定纤溶活性的菌株。再对复筛得到的菌株进行摇瓶培养,用纤维蛋白平板法测定并比较不同菌株发酵液的纤溶活性。结果成功地筛选出5株纤溶活性高和通过溶血性实验的芽孢杆菌菌株,其中菌株DC-C4粗酶液的酶活稍高,达到280IU/mL。采用16S-23S rDNA序列分析法及传统的生理生化特征鉴定法对该菌株进行鉴定,确定菌株DC-C4为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。本实验为开发新型溶栓药物及保健食品提供了实验参考依据。     

产纤溶酶少根根霉菌株的诱变筛选

目的:通过对自南方小酒药中筛选得到的1株产纤溶酶的少根根霉Or株的诱变筛选,提高原有菌株的产酶能力。方法:以Or为出发菌株,进行亚硝基胍、紫外线、Co60诱变,以血纤维蛋白平板法为检测方法,筛选高产酶突变株。结果:经诱变传代后得到高产突变株8B,其产酶活性稳定为291.05U/mL,为原菌株产酶活力的6.34倍。该菌在血琼脂平板上不产生溶圈,诱变后孢子成熟提前8h。结论:物理诱变和化学诱变交替应用,能显著提高少根根霉Or株单位体积发酵液的产酶量,并能缩短孢子的成熟周期。该菌不具有溶血性,与已有报道的产纤溶酶的菌株不同。     

里氏木霉306菌株筛选及其产酶特性的研究

里氏木霉(Trichoderma reesei)306是染色体上整合有组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)cDNA的基因工程菌株。本论文利用筛选平板筛选出产t-PA活力高和产蛋白酶活力高的两种基因工程里氏木霉306菌株,然后对它们发酵过程中的产酶特性进行研究。结果表明:菌株产蛋白酶活力的大小与生物合成t-PA活力大小之间有一定的关系,产蛋白酶活力相对高的菌株产t-PA的活力相对低,而产蛋白酶活力相对低的菌株,产t-PA活力相对就高。     

纳豆激酶的分离纯化研究

从实验室保存的一株高产纳豆激酶菌株出发,进行发酵产酶,确立具有纤溶活力的纳豆激酶的分离纯化工艺,主要通过硫酸铵分级盐析法和Phenyl Sepharose疏水柱层析进行分离纯化,用纤维蛋白平板法测定酶活力,用SDS-PAGE电泳验证为电泳纯,分子量为28kD。其有望开发为新型的口服溶栓药物。     

高溶纤酶活性枯草芽孢杆菌的分离筛选与鉴定

从多个枯草样品中分离纯化得到 2 0株芽孢杆菌 ,并进行了鉴定。通过对固体发酵所产生的溶纤酶的研究 ,发现均能不同程度地产生溶纤酶 ,其中菌株FM-S1、FM-S2、FM-S8、FM-S6、FM-S11产生的溶纤酶活性均高于日本的纳豆杆菌。同时对筛选的菌株的形态和菌落形态、生理生化特性进行鉴定 ,确认所筛选到产酶菌株均属于枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis。另外 ,对FM S2作固体发酵确定在熟大豆上枯草杆菌溶纤酶生物合成的模式为同步合成型。     

重组海蚯蚓纤溶酶的克隆、表达及活性鉴定北大核心CSCD

纤溶酶在溶栓治疗中起重要作用,能够溶解血凝块的主要成分纤维蛋白。采用RACE方法从海蚯蚓消化道组织中扩增出海蚯蚓纤溶酶编码序列,构建该基因原核表达载体,并进一步构建工程菌表达融合蛋白,经Ni2+树脂柱纯化后通过平板法检测该融合蛋白纤维蛋白酶原激活活性。结果获得海蚯蚓纤溶酶的c DNA序列和氨基酸序列,并成功构建重组表达载体p ET-21a-AFE,表达纯化出融合蛋白,该融合蛋白能够激活纤维蛋白酶原而溶解纤维蛋白。总之,本研究获得了海蚯蚓纤溶酶的c DNA序列和氨基酸序列,并初步证明其具有纤维蛋白酶原激活活性,为临床新型溶栓药物的开发提供实验基础。     

产纤溶酶海洋微生物B5815菌株的筛选及鉴定

采用酪素平板、纤维蛋白平板的初筛和摇瓶复筛的方法从205株海洋微生物中筛选得到4株纤溶酶活性较强的菌株,其中菌株B5815产纤溶酶活性最高,平均达258 IU/mL。通过对菌株B5815的形态特征、生理生化特性的测定及16S rDNA序列分析,综合鉴定其为短小芽胞杆菌（Bacillus pumilus）。     

重组海蚯蚓纤溶酶的克隆、表达及活性鉴定

纤溶酶在溶栓治疗中起重要作用,能够溶解血凝块的主要成分纤维蛋白。采用RACE方法从海蚯蚓消化道组织中扩增出海蚯蚓纤溶酶编码序列,构建该基因原核表达载体,并进一步构建工程菌表达融合蛋白,经Ni2+树脂柱纯化后通过平板法检测该融合蛋白纤维蛋白酶原激活活性。结果获得海蚯蚓纤溶酶的c DNA序列和氨基酸序列,并成功构建重组表达载体p ET-21a-AFE,表达纯化出融合蛋白,该融合蛋白能够激活纤维蛋白酶原而溶解纤维蛋白。总之,本研究获得了海蚯蚓纤溶酶的c DNA序列和氨基酸序列,并初步证明其具有纤维蛋白酶原激活活性,为临床新型溶栓药物的开发提供实验基础。     

光裸方格星虫纤溶酶SNFE体外溶栓作用及安全性初评

研究光裸方格星虫纤溶酶SNFE体外溶栓作用并初步评价药物的生物安全性。通过标准纤维蛋白平板和加热纤维蛋白平板实验、剩余可凝纤维蛋白原法、体外溶栓实验研究SNFE体外溶栓作用及作用方式;通过皮下出血实验及体外溶血实验初步评估SNFE的生物安全性。结果发现,SNFE在体外不仅具有激酶活性,且能直接溶解纤维蛋白原和纤维蛋白,对血凝块具有良好的溶栓作用,同时无出血活性及溶血作用,具有一定的开发价值。     

枯草芽孢杆菌BS-26菌株纤溶酶的性质分析及活性组分的分离纯化

[目的]溶栓疗法是血栓性疾病安全且有效的治疗手段,从微生物中寻找溶栓药物是一种理想有效的途径,枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-26菌株发酵液具有很强的体外纤溶活性,本文分析了发酵液中纤溶酶的性质并对活性组分进行了分离纯化.[方法]利用纤维蛋白平板法检测纤溶酶活性,利用硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和聚丙烯酰胺制备电泳等方法,进行分离纯化.[结果]此菌株产生的纤溶酶在50℃以下和pH5.0～11.0范围内具有较好的稳定性,最适作用温度为42℃;最适pH值为9.0;Mg2 、Ca2 对此酶有明显的激活作用,而Cu2 能完全抑制酶的活性;174.2μg/mL的苯甲基磺酰氟、1000μg/mL的鸡卵类粘蛋白和1000μg/mL大豆胰蛋白酶抑制剂能完全抑制酶活性,初步说明此酶属于丝氨酸蛋白酶类;体外溶纤作用表明,该酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解,而不是通过激活纤溶酶原.从该菌株的发酵液中获得了一种纤溶酶组分,比活力达8750 U/mg,回收率为3.2%,所获得样品纯度相对于发酵液提高了41倍,该酶在SDS-PAGE中是单肽链蛋白,分子量为32 kDa.[结论]获得了一种纤溶酶的单一组分,为纤溶酶发酵产品的大规模纯化及进一步研制和开发新的溶栓药物提供重要理论依据.     

响应面法优化解淀粉芽孢杆菌发酵产豆豉纤溶酶的工艺条件

纤溶酶是指能专一降解纤维蛋白凝胶的蛋白水解酶,可用于治疗脑梗死、高凝血状态及血栓性脉管炎等外周血管疾病。解淀粉芽孢杆菌JXNUWX-1是一株从豆豉中分离得到的高产纤溶酶菌株,并保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC No.M2014638)。本研究利用单因素试验和响应曲面法对JXNUWX-1菌株产纤溶酶的发酵条件进行了优化。在单因素试验的基础上通过Design-Expert软件对玉米淀粉、牛肉粉、初始p H这三个较显著的因素进行响应面试验设计,最终获得最佳发酵条件为:玉米淀粉浓度为2.91%,牛肉粉的浓度为1.76%,最适p H为7.47,在此条件下,酶活力为346.62 IU/m L,较优化前纤溶酶活力提高了8.9倍。本研究为解淀粉芽孢杆菌JXNUWX-1大规模生产纤溶酶提供理论依据。     

一株产纤溶酶放线菌的分离和鉴定

目的：从黄精根际土壤筛选产纤溶酶的放线菌,并对其进行鉴定。方法：采用稀释法分离放线菌,利用纤维蛋白平板法筛选能产生纤溶酶的菌株,根据16SrDNA序列、形态学观察和生理生化特征对纤溶活性高的菌株进行鉴定。结果：菌株XZNUM 00004代谢产物的纤溶酶活性为69U/ml,该酶加热到65℃仍能保留85%的活性。经形态学观察,培养特征、生理生化和分子分类学分析鉴定,与胶样链霉菌（Streptomyces gelaticus）相似性为99%。结论：初步推断XZNUM 00004属于链霉菌属（Streptomyces）。     

可口革囊星虫体内纤溶酶的初步研究

目的从可口革囊星虫中寻找到纤溶酶,并对其进行初步研究。方法采用匀浆、抽提离心、Sephacryl S-300凝胶过滤等方法对可口革囊星虫纤溶酶初步分离,用纤维蛋白平板法和合成发色底物法检测其纤溶活性,并用该酶进行体外溶血凝块实验。结果可口革囊星虫内脏中存在纤溶酶。此酶既直接降解纤维蛋白又间接激活纤溶酶原,它对体外血凝块有明显溶解作用。结论可口革囊星虫内脏中存在着一种既具直接降解纤维蛋白作用又具激活纤溶酶原作用的纤溶酶。     

一株新的豆豉纤溶酶产生菌的研究

从全国各地采集豆豉样品,经富集培养并利用纤维蛋白平板法获得一株形态与现存产纤溶酶微生物差异较大的菌株HS9.通过传统方法、化学方法以及16S rRNA序列分析对HS9进行分类鉴定,属于Pseudomonas aeruqinosa,是未见报道的产豆豉纤溶酶菌株.发酵培养HS9获得粗酶,经20%～70%硫酸铵梯度盐析、Sephadex G-75凝胶过滤以及CM-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析分离纯化后,得到了电泳纯酶.通过SDS-PAGE了解该酶分子量约为34 kD,pH 8.0～8.5时酶活性最高,最适作用温度48℃,作用方式为直接水解纤维蛋白,胃蛋白酶抑制剂在工作浓度1μmol/L时能完全抑制其活性,推测该酶为天冬氨酸蛋白酶,是一种新型的豆豉纤溶酶.     

中介蝮蛇毒纤溶酶基因真核表达载体的构建及其功能的研究

目的:蛇毒纤维蛋白溶解酶能直接溶解纤维蛋白或纤维蛋白原,在心脑血管疾病的治疗方面具有潜在的应用价值。方法:采用双酶切技术从pMD18T-FLE I克隆载体上获得中介蝮蛇毒纤溶酶基因编码区,再将其亚克隆到真核表达载体pFASTBACHTa上,经转化、筛选和鉴定,获得重组真核表达质粒pFASTBACHTa-FLE。重组质粒经小鼠尾静脉快速注入小鼠体内,进行瞬时表达。结果:经SDS-PAGE和Western blot检测,表明在小鼠肝脏组织中有重组FLE蛋白表达。免疫组织化学检测证明该蛋白在小鼠肝脏组织中大量表达。纤维蛋白平板法鉴定该重组蛋白具有较高的纤溶活性,其活性呈现出剂量相关性和时间依赖性。因此为进一步对中介蝮蛇毒纤溶酶的应用奠定了坚实的基础。     

蛇毒纤维蛋白(原)溶解酶综述

蛇毒纤维蛋白溶解酶能直接溶解纤维蛋白(原).对蛇毒纤溶酶的深入研究,不仅有助于阐明蛇伤中毒患者的凝血病理机制,而且为其开发应用提供了理论基础.该文综述了蛇毒纤溶酶的研究进展及应用前景,重点阐述了蛇毒纤溶酶的分布和种类、分子结构及酶学特性等方面的内容.     

云南传统发酵豆豉中高产豆豉纤溶酶菌株的筛选及其酶谱分析

从云南昆明、元阳、玉溪、昭通地区采集豆豉样品26个,通过琼脂-纤维蛋白平板试验,SDS-fibrin-PAGE蛋白电泳结合Zymography活性染色对相应酶谱进行分析;同时采用茚三酮法测定其豆豉纤溶酶活性,筛选得到5株豆豉纤溶酶活性较高的菌株,其中尤以ZT-13茵株纤溶酶活性达到97.09 U/mL,是工业化生产豆豉纤溶酶的潜在优良菌株.