SEFA-PCR法克隆灵芝鲨烯合酶基因启动子及其序列分析

鲨烯合酶是灵芝三萜生物合成的关键酶,灵芝鲨烯合酶基因的表达和活性的高低决定了灵芝中三萜含量的高低。根据已经获得的灵芝鲨烯合酶全长cDNA序列设计一对专一引物,通过PCR扩增得到了灵芝鲨烯合酶基因的基因组全长,序列长1984bp,含有3个内含子。根据其基因组序列设计引物,采用SEFA-PCR的方法,以总DNA为模板,克隆了灵芝鲨烯合酶基因的启动子序列,长1042bp。序列分析发现灵芝鲨烯合酶基因启动子中没有明显的TATA和CAAT框,但是含有CCAAT-bindingfactor、GATA-1、GC-box、TFⅡD等重要的转录因子的结合位点,以及在人和酿酒酵母鲨烯合酶基因启动子中发现的甾醇调节相关的顺式调控元件。     

洋常春藤HMGS基因克隆与表达分析

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶(HMGS)是MVA途径中的关键酶基因,其作用主要是催化乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-Co A)。为分析洋常春藤HMGS基因在常春藤皂苷生物合成途径中的功能及调控机制,本研究利用RACE克隆技术克隆获得了洋常春藤HMGS基因c DNA全长序列并进行了生物信息学分析。结果表明:洋常春藤HMGS基因的c DNA全长1 751bp,命名为Hh HMGS(Gen Bank登录号:KX056075),其包含编码468个氨基酸的开放阅读框。预测该基因编码的蛋白质分子量为52.0 k D,理论等电点为5.99。氨基酸序列比对结果表明,洋常春藤中的HMGS与人参的HMGS同源性最高,达到95%。通过RT-q PCR分析Hh HMGS基因在洋常春藤中的时空表达规律,结果表明Hh HMGS基因与常春藤皂苷含量之间并未呈现出相关性。本研究为探讨HMGS基因在常春藤皂苷生物合成途径中的作用以及深入的研究该基因的分子调控机制奠定基础。     

灵芝甾醇14α-脱甲基酶基因的克隆及超量表达对三萜合成的影响

灵芝Ganoderma lucidum是我国传统的药用真菌,三萜类物质是灵芝的主要生物活性成分,甾醇14α-脱甲基酶是三萜合成途径中的关键酶。根据已报道其他物种甾醇14α-脱甲基酶的氨基酸保守序列设计简并引物,获得灵芝甾醇14α-脱甲基酶特异基因片段,并进一步获得灵芝甾醇14α-脱甲基酶基因的全长DNA和cDNA序列。其中DNA序列长1,981bp,cDNA序列长1,635bp。结构基因编码蛋白包含544个氨基酸,分子量为61.99kDa,等电点为6.36。将甾醇14α-脱甲基酶基因的cDNA序列克隆到灵芝超量表达载体pGl-GPD中,利用农杆菌介导的转化法实现了甾醇14α-脱甲基酶基因在灵芝内的超量表达。转化子的甾醇14α-脱甲基酶基因在转录水平表达量增加,三萜含量增加。进一步研究发现,三萜合成途径的关键酶基因Gl-aact、Gl-hmgr及Gl-ls的转录表达量也有所增加。     

油茶3羟酰CoA脱水酶基因的克隆与表达分析

3羟酰CoA脱水酶是一类催化3羟酰CoA脱水转化成为烯酰CoA形式的酶。本研究以国审油茶品种‘华硕’种子为材料,在已构建的转录组和表达谱数据库的基础之上,采用RACE技术,克隆到一个油茶3羟酰CoA脱水酶基因的cDNA全长,命名为CoHCD(Gen Bank登录号KJ910336)。该基因cDNA全长为1145bp,含有666bp的开放读码框,编码221个氨基酸,分子量为25.2kDa,理论等电点p I为9.4,疏水残基占整个氨基酸残基的48.9%,是亲水性蛋白,具有4个比较明显的跨膜区和蛋白质酪氨酸磷酸酶基序"HGXXGXXRS"。在基因c DNA全长序列的基础上,分别成功地构建了原核表达载体、超表达载体和RNA干扰载体,其中,原核表达载体在宿主细胞BL21(DE3)上成功诱导表达,获得表观分子量约为25 k Da的相应目的蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,在5个不同发育时期的油茶种子中CoHCD高效表达主要集中在8~10月,转录最高峰发生在9月,其表达量在种子发育过程中呈增加趋势。     

尾巨桉HMGR基因的克隆及表达分析

基于RACE技术克隆得到尾巨桉3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(EuHMGR)基因全长为1955bp,包含1560bp的开放阅读框(ORF),编码519个氨基酸。生物信息学分析表明EuHMGR包含两个HMG-CoA结合基序和两个NADP(H)结合基序;同源建模得到EuHMGR三维构象呈"V"型,包含N-结构域、S-结构域和L-结构域。将EuHMGR组DNA与cDNA序列进行比对表明EuHMGR存在一个319bp的内含子。通过实时定量PCR进行组织特异性表达分析表明EuHMGR在茎中的表达量最高,叶次之,在根中基本无表达。该研究为后续尾巨桉EuHMGR的功能验证以及遗传转化奠定基础。     

棉花nodulin—like基因及其启动子的结构特征和遗传表达

用同尾酶反向PCR技术(Ⅱ-PCR)和快速分离目的基因cDNA　5'未知序列方法(RICUP)首次从陆地棉品种Y18　(Gossypium　arboreum　L.　Y18)中分离到nodulin-like基因的全长cDNA、DNA和启动子序列。结果表明,该基因全长为2　353　bp,具有5个内含子和6个外显子。cDNA全长1　480　bp,含有一个1　125　bp的ORF结构,编码375个氨基酸,在GenBank　nr数据库中没有与之同源的基因序列,在EST数据库中仅有一条733　bp的亚洲棉纤维EST序列(GenBank登录号:BF271235)与之有92%的同源性。Nodulin-like基因的启动子全长1　969　bp,启动子区域具有Initiator、TATA　box、CAAT-like　box和富含AT序列等启动子特征序列。Southern　blot结果表明:该基因在棉花基因组中有一个拷贝。Northern　blot结果表明:该基因在棉花的蕾、花、纤维和铃壳等生殖器官中呈优势表达。本研究有望为改良棉花生殖器官的农艺性状提供靶基因,并为解决目前转基因抗虫棉“前期抗虫性强、后期抗虫性弱”这一生产实际问题提供有效的表达调控元件。     

钙离子和水杨酸诱导灵芝多糖和三萜的合成

灵芝多糖和三萜是灵芝主要的药理活性物质。如何提高液体发酵中灵芝多糖和三萜的含量是目前研究的热点。本研究以J‐7/AL‐2菌株为例,在灵芝的液体发酵中加入10mmol/L钙离子诱导,多糖含量比对照提高34%,三萜含量提高64%。在发酵液中加入150μmol/L水杨酸(SA)诱导,多糖含量提高57.54%,三萜含量提高37.19%。在灵芝的液体发酵第12天加入10mmol/L钙离子和150μmol/L水杨酸,三萜含量提高46.9%。在不同诱导条件下,三萜的高效液相图谱(HPLC)显示钙离子与对照的差异性比较大。灵芝三萜关键酶基因的表达也有所不同。水杨酸提高法尼基焦磷酸合酶(FPS)、鲨烯合酶(SQS)和羊毛兹醇合酶(LS)基因的表达量,而钙离子和钙离子与水杨酸共同处理提高3‐羟基‐3‐甲基戊二酰辅酶A合酶(HMGS)、3‐羟基‐3‐甲基戊二酰辅酶A转录水平还原酶(HMGR)、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)、法尼基焦磷酸合酶(FPS)、鲨烯合酶(SQS)和羊毛兹醇合酶(LS)6个三萜关键酶基因的表达量。在3种处理下,都是SQS的基因表达量提高最多,推测SQS基因是灵芝三萜合成过程中重要的基因。     

棉花nodulin-like基因及其启动子的结构特征和遗传表达

用同尾酶反向PCR技术(Ⅱ-PCR)和快速分离目的基因cDNA 5'未知序列方法(RICUP)首次从陆地棉品种Y18(Gossypium arboreum L.Y18)中分离到nodulin-like基因的全长cDNA、DNA和启动子序列.结果表明,该基因全长为2 353 bp,具有5个内含子和6个外显子.cDNA全长1480 bp,含有一个1125 bp的ORF结构,编码375个氨基酸,在GenBank nr数据库中没有与之同源的基因序列,在EST数据库中仅有一条733 bp的亚洲棉纤维EST序列(GenBank登录号:BF271235)与之有92%的同源性.Nodulin-like基因的启动子全长1 969 bp,启动子区域具有Initiator、TATA box、CAAT-like box和富含AT序列等启动子特征序列.Southern blot结果表明:该基因在棉花基因组中有一个拷贝.Northern blot结果表明:该基因在棉花的蕾、花、纤维和铃壳等生殖器官中呈优势表达.本研究有望为改良棉花生殖器官的农艺性状提供靶基因,并为解决目前转基因抗虫棉"前期抗虫性强、后期抗虫性弱"这一生产实际问题提供有效的表达调控元件.     

白木香3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(AsHMGS)基因的克隆与表达分析

以白木香(Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg)茎cDNA为模板,采用反转录PCR及RACE技术分离得到HMGS基因cDNA全长。序列分析表明该基因序列全长1 831 bp,共编码465个氨基酸,推导的蛋白质分子量为51.4 kD,理论等电点6.25,命名为AsHMGS。推导的AsHMGS蛋白质序列具有植物HMGS酶的典型结构,并预测出HMGS酶的活性中心。系统进化树分析表明,AsHMGS蛋白与拟南芥、琴叶拟南芥、芥菜的相应蛋白相似度最高,其次为人参、喜树和野茶树。荧光定量PCR结果显示,茉莉酸甲酯能诱导白木香AsHMGS的表达。     

金鱼草AmHMGS基因的克隆及表达特征分析

植物萜烯类化合物合成主要通过MVA和MEP途径,这些萜烯类化合物在植物生长、发育过程发挥着重要作用,萜烯类化合物在植物花香挥发成分中占有大比率.3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因(HMGS)是MVA途径中的关键酶基因,该酶作用主要是催化底物乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A生成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA),是合成萜烯类化合物的前体限速酶.本研究以'马里兰'金鱼草(Antirrhinum majus'Maryland')为材料,克隆AmHMGS,基因全长1 383 bp,编码460个氨基酸,时空和组织特异性RT-qPCR表达分析表明,AmHMGS基因在花中表达量显著高于根茎叶;初开期的表达量最高;在盛花期的不同花器官中,AmHMGS基因在雄蕊和上瓣中表达量最高,与其它花器官中的表达量差异显著.用茉莉酸抑制剂不同浓度的菲尼酮处理盛开期金鱼草花瓣,RT-qPCR分析HMGS基因表达量结果表明,菲尼酮处理后能抑制该基因的表达.本研究的结果为明确AmHMGS基因在金鱼草中的表达模式,为今后研究该基因的功能及其在金鱼草花香释放中的信号作用奠定基础.     

蔓地亚红豆杉3′-N-去苯甲酰-2-脱氧紫杉醇苯甲酰转移酶基因的克隆与序列分析

3′-N-去苯甲酰-2-脱氧紫杉醇苯甲酰转移酶(DBTNBT)是催化紫杉醇生物合成最后一步反应所需要的酶,负责将带有不完全侧链的紫杉醇前体催化形成紫杉醇。利用蔓地亚红豆杉的总DNA和总RNA为模板,采用PCR和RT-PCR技术克隆出DBTNBT基因的DNA序列和cDNA序列,测序结果显示长度分别为1465bp和1362bp,编码438个氨基酸的多肽。同源性比较分析结果表明,其碱基序列与已经报道的蔓地亚红豆杉的DBTNBT基因的一致性为99%,其氨基酸序列与已经报道的蔓地亚红豆杉的DBTNBT氨基酸序列的一致性为96%。DNA序列和cDNA序列比对发现该基因含有1个内含子。利用SWISS-PROT、DNAMAN等生物信息学工具对其蛋白序列进行了分析,为利用基因工程的方法生产紫杉醇或其前体物质提供了分子基础。     

茉莉酸甲酯对灵芝三萜生物合成的影响及其灵芝应答基因的差异表达

灵芝三萜类化合物是灵芝的主要药用成分之一,灵芝三萜含量的多少是衡量灵芝质量高低的重要指标。经研究发现茉莉酸甲酯能显著提高灵芝三萜含量并上调灵芝三萜生物合成途径中的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、法尼酯焦磷酸合成酶和羊毛甾醇合成酶等基因的表达。通过在灵芝中建立的cDNA-AFLP体系,采用64对引物组合对灵芝的转录组进行分析。64对引物组合共产生3 910个TDFs。茉莉酸甲酯不同诱导条件下约有919个TDFs的表达谱发生了变化,占表达谱的23.5%,其中上调表达的有703个,下调表达的有216个。选择458个TDFs进行回收、TA克隆、测序后,获得390个高质量的TDFs片段。通过蛋白数据库同源性检索,并对蛋白功能进行GO分类,结果表明:390个高质量的TDFs中,BlastX比对后没有显著匹配的序列占77.1%。在有匹配蛋白的序列中,与碳代谢及能量相关的基因为最大一组,占35.2%,转录调控类及信号传导类基因分别占14.3%和11.0%。通过荧光定量PCR技术考察了茉莉酸甲酯对20个基因转录水平的影响,与cDNA-AFLP分析的结果相一致。并通过灵芝基因过量表达技术和基因沉默技术对筛选到的相关基因进行沉默和过量表达,研究筛选到的基因在灵芝三萜生物合成与调控中的作用,获得大量参与灵芝三萜生物合成与调控的候选基因,进一步阐明了茉莉酸甲酯诱导下灵芝基因表达的变化图。     

高羊茅FaChit1基因组DNA的克隆及其拷贝数的验定

以获得的高羊茅FaChit1基因cDNA设计引物扩增其基因组DNA,序列比对发现该基因内不存在内含子.进一步采用染色体步移方法分离FaChit1基因上游的一段935 bp启动子序列以及下游的一段470 bp 3′非翻译区序列发现,在该启动子区域内不仅含有保守的TATA盒和CAAT盒,而且包含多个潜在的与胁迫应答有关的顺式调控元件,表明该启动子可能是1个多胁迫诱导型启动子.此外,在FaChit1 3′非翻译区含有真核生物基因中高度保守的特征序列.Southern杂交结果表明,FaChit1在高羊茅基因组中有2个拷贝.     

长春花钙调素基因克隆及其假基因的识别

以长春花[Catharanthus roseus(L.)G.Don]叶片cDNA和基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增得到了长春花钙调素基因447 bp的全长编码cDNA序列和2个大小不同的DNA片段.序列分析表明,DNA长片段全长1 551 bp,由2个外显子和1个内含子构成,为长春花钙调素基因编码区DNA片段;DNA小片段全长447 bp,与447 bp的长春花钙调素基因cDNA核苷酸一致性高达87%,有56个碱基的差异,其中位于226 bp处的碱基A突变为T,即由AAG突变为终止密码子TAG使翻译提前终止.推测此447 bp的DNA小片段可能为长春花钙调素基因的假基因,命名为CCaMP1.     

决明丙二酰CoA:ACP转酰基酶基因的克隆及序列分析

[目的]克隆决明丙二酰Co A:ACP转酰基酶(MCAT)基因并做序列分析。[方法]采用RACE法从c DNA中扩增出决明丙二酰Co A:ACP转酰基酶(MCAT)的CDS全长序列,推测出MCAT基因编码的氨基酸序列并进行序列分析。[结果]分析结果显示MCAT的CDS全长1 253bp,编码405个氨基酸。通过序列比对分析发现决明MCAT蛋白包含一个酰基转移酶超家族结构域,并且发现了一段高度保守的七肽模序。[结论]获得了决明MCAT的CDS全长,其编码的蛋白可能催化丙二酰Co A的转酰基反应,为决明脂肪酸的合成通路的阐明以及后期的决明脂肪酸的基因工程研究打下了坚实的基础。     

光皮桦ACC氧化酶基因BlACO的克隆和表达分析

ACC（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid）氧化酶（ACO）是植物乙烯合成过程中的关键限速酶,对乙烯的合成具有重要的调控作用。以光皮桦茎叶组织提取的RNA为模板,据已报道的ACO同源序列设计简并引物,通过RT-PCR扩增获得部分基因片段,结合5＇,3＇RACE方法从光皮桦中扩增出1个ACO的全长cDNA序列。该基因cDNA全长1262bp,具有一个957bp的完整开放阅读框架,编码含318个氨基酸的蛋白。与其他植物中的ACO基因进行同源性比对的结果显示,BlACO蛋白与欧洲白桦的同源性最高,达到97%。该基因在光皮桦的雄花和雌花中表达量较高,而在茎中的表达量较低。     

丹参转录因子SmMYB7的克隆及表达模式分析

分析丹参转录组数据库(SRX021907),得到一条R2R3-MYB基因,blast比对发现该基因为丹参Sm MYB7(KF059361.1)。分别从g DNA和c DNA水平克隆该基因全长,测序结果表明该基因与公布序列一致,分析发现该基因无内含子序列,包含一个长为954 bp的开放读码框(ORF),编码317个氨基酸残基。多重序列比对和系统进化树分析显示Sm MYB7蛋白与拟南芥At MYB73同属R2R3-MYB第22个亚家族。已有丹参基因信息结合BD walking获得1 974 bp的启动子序列,分析结果表明多种顺式作用元件存在于该基因的启动子区。实时荧光定量PCR分析显示,该基因的表达为组成型,在丹参根、茎、叶、花中都表达;随着花的发育,该基因的表达量逐渐增加;此外,Sm MYB7在盐胁迫、水杨酸、茉莉酸甲酯和脱落酸处理下表达均上调,推测该基因参与调控植物防御和花的发育。     

MOB2基因在真核细胞中的表达研究

通过RT-PCR从培养的HUVECs中扩增MOB2基因片段,将该片段克隆在真核表达载体pEGFP-C1中,转染NIH3T3细胞,经G418筛选,构建稳定表达细胞系,并用荧光显微镜和Western blot对其进行鉴定。经RT-PCR扩增出734 bp基因片段,经测序分析并与GenBank的DNA序列比对分析后,在NIH3T3细胞中表达。G418筛选后,细胞荧光信号较强,Western blot检测,细胞中的融合蛋白能够与抗MOB2的多抗结合。成功地扩增了HUVECs中的MOB2基因全长cDNA并进行真核表达与鉴定。