可分泌性胰高血糖素样肽1融合蛋白cDNA克隆的构建

目的:为了探讨体内分泌表达胰高血糖素样肽1(GLP-1)治疗2型糖尿病的可行性,构建可分泌表达胰高血糖素样肽1的cDNA克隆。方法:实验于2005-09/2006-04在西安华广生物工程公司实验室进行。采用非对称互补引物/膜板法,体外合成两端含有酶切位点的胰高血糖素样肽1的cDNA片段,通过用NaeI和XhoI内切酶消化从NT4cDNA克隆中获取NT4的信号肽和前导序列,通过T4连接酶连接构建分泌表达胰高血糖素样肽1的cDNA克隆。该克隆的特点是确保信号肽酶识别点的正确性。结果:测序证实克隆的胰高血糖素样肽1的cDNA与GeneBank提供的序列完全一致;经限制性内切酶物理图谱方法证实已经成功地将胰高血糖素样肽1cDNA重组到含NT4的信号肽和前导序列下游。DNAsis软件分析结果表明该克隆编码具有信号肽酶识别点的NT4-GLP-1融合蛋白。结论:成功构建了能够分泌表达胰高血糖素样肽1的融合蛋白的cDNA克隆。     

构建重组大鼠pEGFP-N1-IGF-1基因表达质粒

目的：构建胰岛素样生长因子Ⅰ基因的真核表达质粒（pEGFP—N1—IGF—1），为基因治疗脊髓损伤提供前提。方法：实验于2005-04／06在上海基康生物公司实验室完成。应用反转录-聚合酶链反应方法从大鼠肝脏组织总RNA中提取并扩增胰岛素样生长因子Ⅰ基因的全长cDNA，并将该基因连接克隆到含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP—N1上，以构建重组质粒pEGFP—N1—IGF—1。结果：实验从大鼠肝脏组织中提取总RNA，以反转录一聚合酶链反应方法获取编码胰岛素样生长因子Ⅰ基因的全序列cDNA。构建胰岛素样生长因子ⅠcDNA真核表达质粒时将能发出绿色荧光的增强型绿色荧光蛋白报告基因融合在胰岛素样生长因子l基因，并经酶切后DNA电泳鉴定及DNA测序证实。结论：构建重组质粒pEGFP—N1—IGF—1成功，实验中将能发出绿色荧光的增强型绿色荧光蛋白报告基因融合在胰岛素样生长因子Ⅰ基因的3’端，并以编码柔软肽段的核苷酸连接，即保留了胰岛素样生长因子Ⅰ的神经营养活性，又便于基因治疗中可检测到蛋白表达。     

表达胰高血糖素样肽1重组腺伴随病毒载体的构建

背景：胰高血糖素样肽1（glucagon-like peptide-1,GLP-1）在人体内半衰期过短限制了其应用。目的：构建可表达GLP-1的重组腺伴随病毒。方法：将NT4-GLP-1融合基因插入腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV中,构建pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒。采用磷酸钙共沉淀法将辅助质粒pAAV/Ad、腺病毒质粒pFG140及pSSHG/NT4-GLP-1转染至293细胞系,用其感染Hela细胞。结果与结论：重组质粒pSSHG/NT4-GLP-1经限制性内切酶EcoRⅠ酶切鉴定可见342bp的目的片段,说明NT4-GLP-1融合基因已经成功重组于腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV内。免疫细胞化学结果显示,转染pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒的Hela细胞内有大量棕黄色颗粒,阳性率达到70%以上,说明NT4-GLP-1重组腺伴随病毒在细胞中可以表达GLP-1。     

表达胰高血糖素样肽1重组腺伴随病毒载体的构建

背景:胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)在人体内半衰期过短限制了其应用.目的:构建可表达GLP-1的重组腺伴随病毒.方法:将NT4-GLP-1融合基因插入腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV中,构建pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒.采用磷酸钙共沉淀法将辅助质粒pAAV/Ad、腺病毒质粒pFG140及pSSHG/NT4-GLP-1转染至293细胞系,用其感染Hela细胞.结果与结论:重组质粒pSSHG/NT4-GLP-1经限制性内切酶EcoRⅠ酶切鉴定可见342 bp的目的片段,说明NT4-GLP-1融合基因已经成功重组于腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV内.免疫细胞化学结果显示,转染pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒的Hela细胞内有大量棕黄色颗粒,阳性率达到70%以上,说明NT4-GLP-1重组腺伴随病毒在细胞中可以表达GLP-1.     

靶向克隆法构建PEP-1-VP3基因的原核表达载体

目的 利用PCR 产物靶向克隆法构建细胞穿透肽-凋亡素(PEP-1-VP3)的原核表达载体.方法 以PGEX-6P-1/TAT-VP3 质粒为模板,PCR 扩增VP3 基因的366 bp 片段,应用靶向克隆酶,将VP3 基因插入到线性pET15b-PEP-1,得到重组表达质粒pET15b-PEP-1-VP3,经过筛选,挑选出阳性克隆进行Nde Ⅰ和BamHⅠ双酶切图谱分析和重组质粒核苷酸序列分析以鉴定所构建的原核表达载体.结果 PCR产物经过电泳可见366 bp 特征性的VP3 片段,重组的质粒经过双酶切获得了一个大小为440 bp 的特征性PEP-1-VP3 片段,重组质粒测序证实VP3 cDNA 编码区成功地克隆入了pET15b-PEP-1,且其序列与GeneBank 中VP3 cDNA 序列完全一致.结论 靶向克隆法可快速、高效地构建PEP-1-VP3 基因的原核表达载体,为制备PEP-1-VP3 融合蛋白奠定基础.     

构建重组大鼠pEGFP-N1-IGF-1基因表达质粒

目的:构建胰岛素样生长因子1基因的真核表达质粒(pEGFP-N1-IGF-1),为基因治疗脊髓损伤提供前提。方法:实验于2005-04/06在上海基康生物公司实验室完成。应用反转录-聚合酶链反应方法从大鼠肝脏组织总RNA中提取并扩增胰岛素样生长因子1基因的全长cDNA,并将该基因连接克隆到含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1上,以构建重组质粒pEGFP-N1-IGF-1。结果:实验从大鼠肝脏组织中提取总RNA,以反转录-聚合酶链反应方法获取编码胰岛素样生长因子1基因的全序列cDNA。构建胰岛素样生长因子1cDNA真核表达质粒时将能发出绿色荧光的增强型绿色荧光蛋白报告基因融合在胰岛素样生长因子1基因,并经酶切后DNA电泳鉴定及DNA测序证实。结论:构建重组质粒pEGFP-N1-IGF-1成功,实验中将能发出绿色荧光的增强型绿色荧光蛋白报告基因融合在胰岛素样生长因子1基因的3'端,并以编码柔软肽段的核苷酸连接,即保留了胰岛素样生长因子1的神经营养活性,又便于基因治疗中可检测到蛋白表达。     

人胰激肽释放酶基因的克隆及表达载体的构建

目的 :克隆中国人胰组织激肽释放酶基因 ,构建原核、真核表达载体 ,为开发生产人源激肽释放酶基因工程产品及人源激肽释放酶基因药物奠定基础。方法 :提取人胰腺组织总RNA ,逆转录后琼脂糖电泳初步鉴定PCR产物。将激肽释放酶cDNA回收、补平后插入克隆质粒KS ,酶切鉴定后 ,对激肽释放酶基因进行序列测定分析。用双酶切法 ,插入原核表达载体PET 2 8b ,真核表达载体pBacPAK9质粒中。酶切鉴定后 ,进行序列测定分析。结果 :本实验克隆的激肽释放酶基因与GenBank报告的激肽释放酶基因相比 ,碱基序列相同。测序分析表明人胰组织激肽释放酶基因经酶切 ,正确插入到原核表达载体PET 2 8b ,真核表达载体pBacPAK9质粒中。结论 :克隆并构建成功中国人组织激肽释放酶基因的原核、真核表达载体 ,可用于基因工程产品及基因药物的深入研究工作     

人骨形态发生蛋白2与血管内皮生长因子165双基因真核表达质粒的构建及体外表达

目的：构建人骨形态发生蛋白2与血管内皮生长因子165双基因真核表达质粒。方法：实验于2005-03／2005—10在华中科技大学同济医学院公共实验平台完成。①通过聚合酶链反应对pcDNA3．1-BMP2及pUC-CAGGS-VEGF165的目的基因片段亚克隆并引入新的酶切位点，将其分别定向连人真核双表达载体pIPES，构建同时表达两个目的基因的双顺反子，通过聚合酶链反应、酶切分析及DNA序列测定鉴定重组质粒。②重组质粒经脂质体介导体外转染小鼠骨髓基质细胞，通过反转录-聚合酶链反应检测骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165mRNA的表达。结果：①pIRES-BMP2-VEGF165双基因表达质粒的构建和鉴定：将重组质粒pIRES-BMP2-VEGF165分别作XhoⅠ／MluⅠ和Xba Ⅰ／NotⅠ双酶切，经10g／L琼脂糖凝胶电泳可见1．2kbp的人骨形成蛋白2条带和592bp的血管内皮生长因子165条带，酶切条带与聚合酶链反应产物电泳带处于相同位置。经聚合酶链反应、酶切分析及DNA序列测定证实，目的基因插入片段方向正确，DNA序列无突变。②骨形成蛋白2、血管内皮生长因子165mRNA的表达：以转染pIPES空质粒为阴性对照，48h后提取转染细胞的RNA分别用P1，P2和P3，P4作为引物进行反转录一聚合酶链反应。结果表明转染pIPES-BMP2-VEGF165的小鼠骨髓基质细胞扩增出1．2kbp及592bp两条带。证实该重组质粒能在体外同时表达骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165 mRNA。结论：成功构建了可同时表达骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子165的双基因真核表达质粒，为进行联合基因治疗骨缺损的实验研究奠定了基础。     

构建具有突变铜-锌超氧化物歧化酶绿色荧光真核表达载体

目的：构建一个具有特殊临床表型的肌萎缩侧索硬化症家系的突变铜-锌超氧化物歧化酶与有增强绿色荧光蛋白基因的pEGFP—N1融合的真核表达载体。方法：实验于2003—09／2005-01在第三军医大学全军免疫学研究所完成。通过RT-聚合酶链扩增突变铜-锌超氧化物歧化酶cDNA，应用基因重组技术，将得到的突变铜-锌超氧化物歧化酶cDNA克隆入荧光真核表达载体pEGFP-N1中，转化DH5d感受态细胞，用含卡那霉素LB培养基平板筛选转化菌，阳性重组子经EcoRⅠ与BarnHⅠ双酶切分析、测序鉴定。结果：提取到纯度较高的总RNA，通过RT-聚合酶链和基因重组得到重组质粒，应用EcoRⅠ与BarnHI双酶切重组质粒，得到长约130bp和4．6Kb的两条带，前者为插入片段的长度，后者为pEGFP—N1载体本身的长度。测序也最终证实重组载体的方向及序列正确。结论：突变铜-锌超氧化物歧化酶cDNA成功地亚克隆至荧光真核表达载体pEGFP-N1中，获得突变铜-锌超氧化物歧化酶／pEGFP—N1重组质粒，从而为实时监测突变铜-锌超氧化物歧化酶基因在体内的表达和蛋白定位提供一个有用的工具载体。     

重组Mash1慢病毒表达载体的构建

目的:克隆小鼠Mash1基因的全长cDNA,构建其慢病毒表达载体Lentivirus-Mash1,为进一步研究Mash1在神经发育及干细胞神经分化中的作用奠定基础。方法:应用RT-PCR从小鼠13d胚胎中扩增出Mash1cDNA片段,经回收纯化与pGEM-T载体连接并转化感受态细菌J M109,通过蓝白筛选、PCR扩增和双酶切鉴定出阳性菌落,并对其进行基因测序。BamHⅠ和XholⅠ双酶切pGEM-T-Mash1和Lentivirus获得的目的基因双粘片段与Lentivirus双粘线性质粒相连接,转化J M109,酶切方法鉴定重组阳性菌落。结果:PCR扩增、酶切分析及序列测定证实成功获取Mash1cDNA克隆;酶切鉴定证实Lentivirus-Mash1含有大小正确的正向Mash1cDNA片段。结论:成功建立了小鼠Mash1cDNA克隆并构建了慢病毒表达载体Lentivirus-Mash1。     

The characteristics of interpretation of results of analysis of protein amount in urine of pregnant women

The adequacy of implementation of present proteinuria diagnostic thresholds under examination of pregnant women was examined. The analysis was applied to all urine samples of pregnant women from December 2009 to March 20010. The amount of protein in urine was concurrently evaluated by turbidimetric analysis with sulfosalicylic acid, colorimetric analysis with pyrogallol red, "dry chemistry" technology (the diagnostic strips). It is established that the mentioned techniques of analysis of protein in urine provide independent results. The results of colorimetric analysis are characterized by better precision and adequacy. However, in case of pregnant women the diagnostic threshold of protein concentration should be shifted from 0.120 to 0.150 g/l.     

超声评价放疗对颈动脉溃疡斑块形成的影响

目的 探讨超声在评价放疗对颈动脉溃疡斑块形成的影响的价值。方法 回顾性收集经病理学证实为头颈部肿瘤、放疗前后的颈动脉超声资料以及其他基线资料完整的患者93例,比较放疗前后放疗侧颈动脉和非放疗侧颈动脉粥样硬化斑块和溃疡斑块的总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积。结果 放疗前后颈动脉超声检查的平均间隔时间为（6.1±1.9）年;放疗前放疗侧斑块总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、溃疡斑块的总数量、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积与非放疗侧比较差异均无统计学意义（P均>0.05）;放疗后放疗侧斑块总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、溃疡斑块的总数量、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积均较非放疗侧加重,差异有统计学意义（P均<0.05）。结论 放疗可导致头颈部肿瘤患者颈动脉粥样硬化斑块的形成和进展,且斑块具有易损性特点。     

《中国内镜杂志》主编雷光华教授简介

雷光华男,1970年12月生,骨科学博士,一级主任医师,二级教授,博士生/后导师。国家"万人计划"领军人才,教育部"长江学者"特聘教授,科技部"中青年科技创新领军人才",国家卫生计生突出贡献中青年专家,享受国务院政府特殊津贴专家,国家临床重点专科骨科和运动医学学科带头人,全国青年岗位能手,湖南省"芙蓉学者"特聘教授,湖南省科技领军人才和骨科学科领军人才,湖南省普通高校学科带头人,湖南省首届"优秀科技工作者",中南大学"湘雅名医"。     

超声诊断主动脉窦瘤

本文报告31例主动脉窦瘤患者,全部用二维超声(2DE)和多普勒超声检查。其中手术治疗24例,超声符合22例,符合率为92％。误诊2例,误诊率为8％。故超声实际诊断主动脉窦瘤29例中右冠窦瘤18例(62％),无冠窦瘤7例(24％),二叶瓣型主动脉窦瘤4例(14％)。窦瘤破入/膨入右室和右房内的例数分别为16例和13例。本病主要的合并症为主动脉瓣关闭不全和室缺。通过分析我们认为二维加多普勒超声是诊断主动脉窦瘤最有价值的无创技术。