NF-κB超抑制物IκBαM重组腺病毒的构建

目的 在克隆IκBα基因并构建IκBαM的基础上，构建重组腺病毒AdIκBαM。方法 将IκBαM克隆至穿梭质粒，线性化后与骨架质粒共同转染BJ5183菌，构建重组腺病毒质粒。酶切及PCR法鉴定；将其线性化后转染293细胞，观察绿色荧光以确定转染结果，以Western blot法检测目的基因表达。结果 凝胶电泳及行酶切鉴定表明同源重组成功；一PCR产物测序证明确为lxBaM；以重组腺病毒质粒转染293细胞，见绿色荧光；感染293细胞得到大量病毒。结论 成功构建了IκBαM重组腺病毒，为进一步研究奠定了基础。     

腺病毒介导CTLA4Ig和Iκ-Bα双基因在ECV304细胞中的表达

目的: 通过制备细胞毒性T淋巴细胞相关抗原 4融合蛋白(CTLA4Ig)和核因子的抑制蛋白 (Iκ- Bα)双基因共表达腺病毒载体, 检测重组腺病毒在ECV304细胞中的表达。方法: 将Iκ- Bα和CTLA4Ig通过内部核糖体进入部位(IRES2 )连接, 并以基因重组的形式插入腺病毒表达载体, 构建重组腺病毒, 检测Iκ- Bα和CTLA4Ig在ECV304细胞中的蛋白表达情况及其对炎症介质TNF的调控效应。结果: ( 1 )构建pAdTrack -CMV- CTLA4Ig IRES2- Iκ-Bα, 与pAdEasy在BJ5183重组后转染 293, 获得重组腺病毒。(2)PCR鉴定重组腺病毒正确。(3)用重组腺病毒感染体外培养的ECV304后,该腺病毒可表达Iκ- Bα蛋白及CTLA4Ig蛋白, 且可以下调LPS攻击后TNF α的产生。结论: 构建人CTLA4Ig, Iκ- Bα双基因共表达腺病毒载体, 可以有效的抑制炎症因子的表达,为进一步的CTLA4Ig免疫耐受基因治疗中的抑制, 因NF- κB的过度激活而产生的炎性反应提供研究基础。     

IκBαM重组腺病毒的构建

为从分子水平研究NF κB/IκBα系统复杂的生物学功能特别是在肿瘤抗凋亡机制中的作用、进而应用其进行肿瘤及其它多种疾病的基因治疗研究 ,我们在成功克隆IκBα基因基础上 ,构建了NF κB超抑制物IκBαM。在此基础上应用新型腺病毒载体构建系统AdEasysys tem构建重组腺病毒AdIκBαM。首先将目的基因IκBαM克隆至穿梭质粒Track CMV质粒 ,提取重组Track IκBαM质粒 ,行单酶切及双酶切鉴定 ,表明重组穿梭质粒Track IκBαM构建成功。以碱法提取重组穿梭质粒Track IκBαM基金项目 :国家 863计划资助项目( 2 0 0 1AA2 1712…     

共表达IκBα-IRES2-CD40L胞外区双基因的腺病毒载体构建及鉴定

目的:构建含有分泌型人CD40L胞外区(shCD40L)和IκB的双基因共表达的腺病毒载体。方法:分别扩增出目的基因片段shCD40L、IκB和IRES2,将目的基因进行连接,得到IκB-IRES2和shCD40L两个基因片段,将其分别导入pGEMT-easy载体进行亚克隆扩增,测序正确后,再将连接成功地两个目的基因片段与分别与载体pshuttle-CMV连接获得穿梭质pshuttle-CMV-shCD40L和pshuttle-cmv-IκB-IRES2,将穿梭质粒在DH5α感受态细胞中扩增。再与AdEasy-1-BJ5183菌同源重组,得到含有两个目的基因的腺病毒骨架,脂质体法转染293细胞,包装成具有感染能力的共表达IκB-IRES2-shCD40L腺病毒颗粒。PCR法对腺病毒的上清液中的表达差异进行鉴定,检测病毒滴度,并用其感染细胞PK15和293细胞以检验其安全性。结果:所构建的IκB-IRES2-shCD40L基因的重组腺病毒,经酶切和PCR鉴定正确,原代腺病毒的滴度达到6.561×1012pfu/L,PCR法从提取的病毒上清液中分别扩增出了是shCD40L(600bp)和IKBa(700bp)的特异性片段,感染了腺病毒后的PK15细胞形态未见明显异常,但293细胞出现了明显的气球样变。结论:成功构建了共表达IκBα-IRES2-shCD40L双基因的腺病毒载体。     

大鼠siTLR4重组腺病毒载体的构建及功能鉴定

目的构建特异性针对大鼠TLR4基因的siRNA重组腺病毒载体,为进一步研究TLR4在不同疾病中的免疫调节机制奠定重要基础。方法设计并合成3对大鼠TLR4基因的siRNA序列,退火处理后定向克隆到pSES-HUS穿梭质粒中,获得pSES-HUS-siTLR4,经Pme I线性化后与pAdEasy-1骨架质粒在BJ5183细菌中进行同源重组,从而构建pAd-siTLR4质粒,通过脂质体转染,在HEK293细胞中包装形成Ad-siTLR4腺病毒颗粒,用该病毒感染PC12细胞,从基因和蛋白质水平分别检测3对siTLR4的抑制效果,同时从蛋白质水平检测TLR4下游关键分子NF-κB的表达。结果 PCR、酶切和测序均证实目的基因正确克隆到所构建的pAd-siTLR4重组腺病毒载体中;经包装获得的Ad-siTLR4病毒颗粒在PC12细胞中能够有效地抑制TLR4 mRNA和蛋白水平的表达,并显著地降低了NF-κB的表达。结论成功构建了pAd-siTLR4重组腺病毒质粒,同时包装获得了Ad-siTLR4重组腺病毒,转染PC12细胞后不仅能明显降低TLR4的表达,而且有效地抑制了TLR4通路下游关键分子NF-κB的表达。     

表达人IL-17F重组腺病毒载体的构建及其表达产物的功能研究

目的构建表达人白细胞介素IL-17F （hIL-17F）的重组腺病毒载体（Ad-hIL-17F），为进行hIL-17F基因表达抑制血管形成和抑瘤效应的研究奠定基础。方法以pUCm-T/hIL-17F重组质粒为模板PCR扩增hIL-17F，酶切连接到带有GFP标记的pAdTrack-CMV转移质粒上，PmeⅠ线性化重组质粒pAdTrack-CMV-hIL-17F，与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌，经同源重组，获得同源重组腺病毒质粒pAdEasy-1-pTrack-CMV-hIL-17F经PacⅠ线性化后转染QBI-293A细胞，收获Ad-hIL-17F，用RT-PCR和间接免疫荧光法鉴定人IL-17F基因表达。 MTT法检测hIL-17F基因表达对ECV304细胞的生长抑制作用， ELISA法检测人血管内皮生长因子（ VEGF）和血管生成素（ Ang-1）基因在293A细胞、ECV304细胞中的表达水平；实时定量RT-PCR检测Ad-hIL-17F对293A细胞中人VEGF转录的影响。结果测序显示hIL-17F序列正确，RT-PCR和间接免疫荧光法检测到了IL-17 F基因的表达。 Ad-hIL-17 F能显著抑制ECV304细胞的生长，抑制人VEGF和Ang-1基因在293 A细胞、ECV304细胞中的表达。结论成功构建和获得了hIL-17F的重组腺病毒载体（Ad-hIL-17F）， Ad-hIL-17 F可通过下调VEGF和Ang-1的分泌而抑制血管形成。     

重组腺病毒ΔN IκBα的构建及其对A549细胞中NF-κB活性的抑制

目的: 探讨ΔN IκBα基因对NF-κB活性的调节作用.方法: 构建去除Ser32和Ser36磷酸化位点的IκBα重组腺病毒Ad-ΔN IκBα.A549细胞分为3组: 即LPS组、 Ad-LacZ+LPS组和Ad-ΔN IκBα+LPS组.LPS组单纯用内毒素(LPS)激活NF-κB; Ad-LacZ+LPS 组及Ad-ΔN IκBα+LPS 组在用LPS前2 d, 分别感染Ad-LacZ和Ad-ΔN IκBα.用Western blot、电泳迁移率变动分析(EMSA)和ELISA法分别检测LPS刺激后5 h, 细胞总蛋白中NF-κB的活性和培养上清中TNF-α及IL-6的含量.结果: Ad-ΔN IκBα+LPS组NF-κB的活性, TNF-α和IL-6的含量, 均显著低于LPS组及Ad-LacZ+LPS组.结论: 突变后的IκBα可明显抑制NF-κB活化, 减少TNF-α和IL-6的释放, 有望成为一种强有力的抗炎治疗制剂.     

铜绿假单胞菌活菌诱导不同分化状态的U937细胞表达IL-8的研究

目的探讨铜绿假单胞菌（Pseudomonas aenginasa，Pα）活菌对不同分化状态的U937细胞表达IL-8的诱导作用及通过蛋白激酶C（PKC）和核因子κB（NF-κB）的调控机理。方法采用ELISA和RT-PCR法，分别对Pα诱导不同分化状态的人单核白血病细胞系U937细胞分泌IL-8及U937细胞IL-8 mRNA表达进行研究，应用Western blot检验IκB及NF-κB的蛋白表达，观察PKC和NF-κB活化抑制剂对IL-8表达的影响。结果Pα可促进U937细胞及佛波酯（PMA）分化的U937细胞IL-8 mRNA的表达及IL-8的分泌，而且具有明显的量效和时效关系。Pα能直接诱导并迅速活化NF-κB，1h达到高峰，以后逐渐下降。PKC阻断剂calphostin C及NF-κB阻断剂PDTC均能显著抑制NF-κB的活化及IL-8的表达（P〈0．01）。结论IL-8的产生可能与U937细胞的分化状态有关；Pα可能通过PKC信号通路促进NF-κB的活化，从而启动IL-8的高效表达和分泌。     

显性失活IκBα质粒对胰腺癌PC-3细胞株核因子-κB和环氧合酶-2表达的影响

目的：观察显性失活IκBα质粒转染胰腺癌PC-3细胞株后，对细胞核因子-κB（NF-κB）和环氧合酶-2（COX-2）表达的影响。 方法： 免疫组织化学证实NF-κB和COX-2在胰腺癌PC-3细胞株中的表达，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western blotting）检测PC-3细胞转染显性失活IκBα质粒后，细胞中NF-κB和COX-2表达的变化。 结果： 胰腺癌PC-3细胞株中存在NF-κB和COX-2的表达，转染显性失活IκBα质粒后，细胞中NF-κB和COX-2表达均下调，且体现出一定的时间依赖性关系。 结论： 胰腺癌PC-3细胞株中存在NF-κB和COX-2的阳性表达。显性失活的IκBα质粒可抑制细胞中NF-κB和COX-2的表达。     

HSP72过度表达对脂多糖刺激的巨噬细胞中NF-κB活性的影响

目的研究过度表达的热休克蛋白72(heat shock protein,HSP72)对脂多糖(lipopolysaccha-ride,LPS)刺激的巨噬细胞中NF-κB活性的影响.方法构建pCD-hsp72重组质粒,转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,G418筛选稳定转染hsp72基因的细胞,Western印迹检测转染细胞HSP72的表达水平及LPS刺激后RAW264.7细胞内HSP72的表达水平、LPS刺激后转染细胞中IκBα的含量和胞核中NF-κB的含量的变化.结果构建pCD-hsp72重组质粒并转入巨噬细胞,获得稳定转染hsp72基因的细胞株,LPS刺激细胞内HSP72表达增加;HSP72可通过减少LPS刺激的巨噬细胞中IκBα的降解而抑制NF-κB活性.结论HSP72能抑制LPS激活的巨噬细胞中NF-κB的活化.     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在前列腺癌细胞株PC-3M中对核因子kappa B活化的影响

目的：研究TRAIL诱导激素非依赖前列腺癌细胞株PC-3M过程中核因子kappa B（NF-κB）的活化和失活现象。方法： 当不同浓度的TRAIL和LPS作用于细胞后，我们通过细胞免疫组化染色和凝胶电泳迁移试验（EMSA）来检测NF-κB核转位的情况。并通过RT-PCR的方法粗略评定二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）对抑制蛋白IκB的影响。结果： EMSA和免疫组化分析显示PC-3M细胞中NF-κB的核转位可被TRAIL或LPS明显地激活。以PDTC预处理可以上调抑制蛋白IκB的表达，阻断NF-κB的核转位。结论： TRAIL的作用于激素非依赖前列腺癌细胞时主要的负作用在于其可以显著地刺激NF-κB的活化。另一方面，在PC-3M细胞凋亡过程中NF-κB的核转位可以被PDTC有力地抑制，同时IκB的表达升高和降解减少（PDTC引起的）是抑制NF-κB活化的潜在因素，为我们提出了增强TRAIL疗效的可能性方案。     

人IκBα基因原核表达质粒的构建及TrxA/IκBα融合蛋白的制备

目的利用基因重组技术构建人IκBα基因原核表达质粒,制备TrxA/IκBα融合蛋白,以便进一步研究IκBα的生物学功能和制备相应抗体. 方法以重组质粒pGEM-T-IκBα为模板,利用PCR方法扩增出带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的人IκBα基因cDNA,经相应酶切后插入原核表达载体pET-32a(+).重组表达质粒pET32a(+)-IκBα转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达TrxA/IκBα融合蛋白.Western blot试验鉴定表达蛋白.超声波破菌后采用Ni-NTA树脂对TrxA/IκBα融合蛋白进行纯化. 结果酶切鉴定证实人IκBα基因cDNA已插入原核表达载体pET-32a(+).重组表达质粒pET32a(+)-IκBα在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达了TrxA/IκBα融合蛋白,其相对分子质量(Mr)约为56×103,表达量约占细菌总蛋白的25%.Western blot试验显示TrxA/IκBα融合蛋白与兔抗IκBα多克隆抗体呈特异性免疫反应.经Ni-NTA树脂纯化后,TrxA/IκBα融合蛋白的纯度可高达95%以上. 结论人IκBα基因原核表达质粒的构建及TrxA/IκBα融合蛋白的制备为进一步研究IκBα的生物学功能和制备相应抗体奠定了物质基础.     

血管紧张素Ⅱ对人内皮细胞转录因子NF-κB的激活机制及其对血小板源生长因子B链基因转录的影响

目的研究血管紧张素Ⅱ对ECV304细胞中转录因子NF-κB的作用和对血小板源生长因子B链(PDGF-B)基因表达的影响.方法采用电泳迁移率移动分析法(EMSA),免疫组织化学方法,共聚焦显微镜及金颗粒标记免疫电镜技术;荧光素酶报告基因与变异型激酶质粒共转染的方法及Northern印迹法研究血管紧张素Ⅱ激活ECV304细胞NF-κB的信号传递路径和检测了血管紧张素Ⅱ刺激前后ECV304细胞PDGF-BmRNA的表达水平.结果血管紧张素Ⅱ刺激后,在ECV304细胞内有NF-κB的激活及核易位过程,应用免疫荧光共聚焦显微镜,免疫电镜及Northern印迹等方法均可观察到PDGF-B或其基因表达增高.变异型激酶质粒IKKα-KM,IKKβ-KM及NIK-Km可抑制经血管紧张素Ⅱ刺激的转染细胞内与NF-κB启动相连的荧光素酶的表达.结论血管紧张素Ⅱ可激活胞质内NF-κB并出现核易位,激酶NIK、IKKα和IKKβ参与了此信号传递路径.血管紧张素Ⅱ刺激后PDGF-B链mRNA水平增高.     

Calpain inhibitor I对烧伤小鼠肝脏NF-κB转录及炎性细胞因子分泌的影响

探讨Calpain inhibitorI（CI—I）对严重烧伤小鼠肝脏IκBα表达，NF-κB转录及炎性细胞因子分泌的影响。将CI-I腹腔给药预处理小鼠1h后背部行20％全身体表面积（TBsA）Ⅲ度烧伤，收集肝组织，检测其IκBα表达，NF-κB转录和血清TNF-α、IL-1β、IL-6分泌水平。与烧伤对照组比较，CI-I预处理后肝脏NF-κB转录活性和炎性细胞因子分泌有所降低。提示CI-I预处理可有效抑制严重烧伤小鼠肝细胞NF-κB活化和血清炎性细胞因子分泌，从而有利于烧伤后的炎症调节。     

pcDNA3.1/NF-κB(p65)表达载体的构建及蛋白表达

目的克隆NF-κB(p65)基因,构建真核表达载体pcDNA3.1/NF-κB(p65),并进行体外表达研究。方法提取B16总RNA,RT-PCR扩增出NF-κB(p65)基因片段,并将其克隆到pcDNA3.1载体中进行序列分析,转染到B16细胞中,Real-time PCR和Western-blot检测NF-κB(p65)的抗原性和表达量。结果获得高质量的B16总RNA,RT-PCR扩增出1.65kb的cDNA片段,成功构建了pcDNA3.1/NF-κB(p65)载体,Blast序列分析与GenBank中NM_009045.4完全一致。NF-κB(p65)重组蛋白具有抗原性,其基因和蛋白表达高于B16细胞组和空质粒pcDNA3.1组。结论成功构建pcDNA3.1/NF-κB(p65)表达载体和表达出具有NF-κB(p65)抗原性的重组蛋白。     

SUMO化修饰对高糖诱导的大鼠肾系膜细胞IκB/NF-κB信号的影响

目的 探讨小泛素相关修饰物(SUMO)修饰对高糖诱导的肾系膜细胞IκB/NF-κB信号的影响.方法 体外培养正常大鼠肾小球系膜细胞,设对照组、不同浓度高糖干预组和渗透压对照组,用免疫共沉淀检测SUMO1,SUM02/3蛋白与IκBα蛋白的相互作用;免疫印迹检测IκBα、NF-κB P65蛋白表达.结果 高糖特异性地减弱肾系膜细胞SUMO2/3与IκBα蛋白间的相互作用(P＜0.05);高糖呈浓度-时间依赖性促进IκBα泛素化降解(P＜0.05),同时上调NF-κB P65表达(P＜0.05).结论 高糖特异性减弱IκBα的SUMO化修饰,可能介导了肾系膜细胞、NF-κB信号的激活,参与了糖尿病肾病的发病.     

rhGH对Jurkat细胞中NF-κB活性的影响

目的:探讨重组人生长激素(rhGH)对Jurkat细胞核因子-κB(NF-κB)信号通路活化的影响.方法:(1)将含荧光素酶报告基因的质粒pNF-κB-luc转染入T淋巴细胞系-Jurkat E6-1细胞中,在培养液中加入梯度浓度rhGH.(2)用梯度浓度rhGH直接刺激Jurkat细胞,然后用RT-PCR方法检测IκBα、IKK1 mRNA表达情况.结果:各浓度rhGH对转染pNF-κB-luc的Jurkat细胞中荧光素酶表达有促进作用,而对IκBα、IKK1 mRNA表达无显著影响.结论:rhGH对PHA活化的T细胞NF-κB的活化有促进作用,而对与NF-κB活化相关的IκBα和IKK1的mRNA表达无显著影响.     

去甲斑蝥素增强Bel7402中IκBα表达和抑制细胞增殖的研究

目的　从核转录因子 NF- κB和其抑制分子 IκBα的相互作用揭示去甲斑蝥素的抗肿瘤作用机理 ,为其进一步开发利用提供理论依据。　方法　选用人肝癌细胞株 (Bel740 2 ) ,常规培养 ,分为细胞对照组及去甲斑蝥素不同浓度组 ,进行细胞生长曲线测定、细胞集落形成实验及 MTT实验 ;同时对细胞进行 Giem sa染色、免疫细胞化学染色 (一抗分别为 anti- p6 5、anti- IκBα)。Western blot检测 IκBα的表达。　结果　生长曲线测定 ,细胞集落形成实验及 MTT实验结果表明 ,去甲斑蝥素对人肝癌细胞株的生长有明显的抑制作用 ;免疫细胞化学及 Western blot结果显示 :去甲斑蝥素可增强细胞内 IκBα的表达 ,并抑制 NF- κB的表达与活性。　结论　去甲斑蝥素有良好的抗肿瘤效应 ,其作用机理可能与其能增强核转录因子 NF- κB的抑制分子 IκBα的表达有关。     

白芍总苷对巨噬细胞一氧化氮和诱导型一氧化氮合酶生成的影响及其机制研究

目的：探讨白芍总苷（TGP）抗炎作用与调节巨噬细胞一氧化氮（NO）的产生及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达的关系,并从调控核转录因子-κB（NF-κB）活性的途径探讨其作用机制。方法：预先用不同浓度的TGP与大鼠腹腔巨噬细胞共同孵育,然后加入脂多糖（LPS）刺激细胞,检测细胞培养液中NO的产生,Westernblot方法检测iNOS的表达和NF-κB抑制蛋白α（IκBα）的含量,同时检测NF-κB与DNA的结合活性。结果：TGP显著抑制了LPS诱导的大鼠腹腔巨噬细胞产生NO、表达i-NOS,同时也显著增加了细胞内IκBα蛋白的含量和抑制了NF-κB与DNA的结合活性。结论：TGP的抗炎作用与其通过抑制巨噬细胞NF-κB的活性,从而降低巨噬细胞iNOS的表达、减少NO产生密切相关。     

中国人IκBα基因的克隆和序列分析

目的 克隆中国人IκBα基因，了解其与欧美人种有无不同，为进一步的研究工作打下基础。方法 从中国人外周血中分离单个核细胞，刺激细胞贴壁30min后提取总RNA。应用RT－PCR法扩增目的基因，胶回收法纯化。将其连接到pGEM-T质粒载体，进行测序并与已知IκBα序列进行同源性分析。结果 中国人IκBα基因与genebank中发表的人IκBα基因序列仅2个碱基不同且所编码氨基酸无改变。结论 我们已成功克隆了中国人IκBα基因。同源性分析表明，其与genebank中所报道的基因序列基本一致。