结核分枝杆菌Mtb81蛋白的克隆、表达及抗原性分析

目的对结核分枝杆菌Mtb81抗原基因进行克隆、表达及纯化,并评价其抗原性。方法应用聚合酶链反应技术扩增结核分枝杆菌H37Rv Mtb81 DNA序列;将目的基因构建大肠杆菌高效表达株;亲和层析柱纯化重组蛋白;经SDS-PAGE电泳鉴定;通用ELISA法进行重组蛋白的抗原性检测分析。结果获得了结核分枝杆菌抗原Mtb81基因,在大肠杆菌BL21中高效表达,Western印迹结果证实该重组蛋白能与抗结核分支杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应。ELISA分析中,该纯化的重组抗原敏感性、特异性和准确性分别为:35.8%、98.3%和56.7%,具有良好的抗原性和较高的特异性。结论结核分枝杆菌Mtb81重组蛋白抗原具备良好的抗原性与特异性,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及抗原、抗体的大规模制备打下基础。     

重组人3型腺病毒六邻体蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备抗人3型腺病毒六邻体蛋白的单克隆抗体并对单抗进行鉴定.方法 用纯化的重组六邻体蛋白免疫BALB/c小鼠.取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合.经ELISA间接法筛选和克隆化培养,获得4株分泌抗腺病毒六邻体蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,纯化其腹水获得单抗.使用ELISA、Western blot和中和实验等方法鉴定单抗的敏感性、特异性以及中和活性.结果 ELISA和免疫印迹结果表明这4株单抗与腺病毒六邻体蛋白可以特异性结合.而且,4C6株单抗具有中和活性.结论 获得了4个单抗为腺病毒六邻体蛋白的单克隆抗体,可用于3型腺病毒的早期诊断和药物治疗的研究.     

登革2型病毒重组E蛋白的生物学特性分析

【目的】检测重组D2V全长E蛋白纯化后的免疫反应性与抗原性,为其亚单位疫苗研制奠定基础。【方法】酵母表达上清超滤浓缩后用金属螫合亲和层析(MCAC)法过柱,用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术观察蛋白条带。将纯化蛋白与组氨酸抗体、D2V E单抗进行斑点印迹和蛋白印迹,以确定纯化物是否为合组氨酸尾的D2V E融合蛋白,并用ELISA检测纯化E蛋白与不同DV抗体的结合反应。用纯化的重组D2V E蛋白免疫小鼠后测定其产生的抗体类型与滴度,以分析其抗原性。【结果】表达产物经MCAC柱纯化获得单一的相对分子质量为69×10~3的蛋白,组氨酸抗体与D2V E单抗的印迹试验证实该条带就是含多聚组氨酸尾型特异的重组E蛋白(rEgp),ELISA显示纯化的rEgp保留有免疫反应性及型特异性,内糖苷酶H消化证实其含有N联高甘露糖残基。接种rEgp可诱生针对D2V抗原与重组E蛋白的高效抗体。【结论】纯化的D2V全长E蛋白保留其免疫原性和免疫反应性,并具有型特异性。     

重组人Jo-1抗原的表达、纯化以及免疫特异性检测

目的 表达纯化重组人Jo-1抗原,免疫印迹和ELISA检测其免疫特异性.方法 IPTG诱导含有Jo-1基因的重组菌,获得高表达的可溶性融合蛋白(MBP-Jo-1),亲和层析纯化该表达蛋白,免疫印迹和ELISA分别检测其抗原性并与生化提取的Jo-1抗原比对.结果 表达的重组Jo-1蛋白具有Jo-1抗原的特异性.结论 重组Jo-1蛋白与天然Jo-1抗原具有相同的免疫原性和免疫原特异性.     

人3型腺病毒纤突的原核表达及其免疫原性分析

目的克隆表达人3型腺病毒(HAdV-3)的纤毛蛋白纤突片段(knob),分析其免疫原性,为腺病毒临床诊断试剂及新型疫苗的研发奠定基础。方法 PCR扩增knob基因片段,克隆到表达载体pGEX-4T-3中进行诱导表达,SDSPAGE电泳分析表达产物,包涵体溶解复性后亲和层析纯化融合蛋白,Western blot鉴定,纯化的蛋白免疫小鼠制备抗血清,间接ELISA法检测小鼠血清的效价,Western blot鉴定抗血清特异性。结果成功构建了重组原核表达质粒pGEX-Ad3 knob,其在大肠杆菌中高效表达并纯化重组knob融合蛋白,融合蛋白免疫小鼠抗血清效价高达10~7,Western Blot证实此抗血清可识别人3型腺病毒纤维蛋白。结论成功获得了重组HAdV-3 knob蛋白,其具有强免疫原性,可以作为研发人3型腺病毒入侵机制研究、诊断试剂及疫苗研发的原料。     

Cpn0585蛋白的免疫活性及血清学诊断初步评价

目的克隆肺炎嗜衣原体包涵体膜蛋白Cpn0585基因,初步探讨其在血清学诊断中的应用价值。方法构建pGEX-6p-2／Cpn0585重组质粒,诱导表达并纯化重组蛋白,免疫BALB／c小鼠,间接酶联免疫附试验（ELISA）检测小鼠血清抗体滴度,以重组蛋白作为ELBA包被抗原检测血清中CpnIgG抗体和检测36份Cpn-／Ct＋IsG阳性参考血清。结果高效表达和纯化出一相对分子质量约为95kDa的重组蛋白,蛋白质印迹法证明其能与人抗CpnIgG抗体发生反应;在被免疫的BALB／c小鼠体内,特异性IgG抗体的滴度为1：12800;检测104例临床血清标本中的IgG抗体,与以色列SavyonDiagnostics公司SeroCPTMIgGELISA诊断试剂盒的检测结果进行比较,符合率为98．3％。结论表达的Cpn0585重组蛋白具有良好的免疫活性,在Cpn的血清学诊断中具有较高的应用价值。     

蛋白激酶SGK2α在大肠杆菌中的表达纯化及抗体制备

目的 该研究通过SGKα基因的克隆、原核蛋白表达以及纯化,制备抗SGK2α抗体,为进一步研究SGK2α蛋白的生物学功能奠定基础.方法 利用原核表达载体PGEX-4T-3构建重组质粒,并在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白:以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗SGK2α多克隆抗体,ELISA方法检测抗体效价,免疫印迹法检测抗体的特异性.结果 构建了PGEX-4T-3-SGK2α原核表达质粒,经原核表达和亲和层析获得GST-SGK2α融合蛋白,蛋白纯度在90%以上;利用GST-SGK2α融合蛋白制备多克隆抗体,抗体效价阳性且具有较强的特异性.结论 利用原核表达的GST-SGK2α融合蛋白成功地制备了抗SGK2α多克隆抗体,可用于免疫组织化学和免疫印迹检测以及功能研究.     

BLCAP蛋白多克隆抗体制备及其免疫学特性鉴定

目的:利用大肠杆菌BL21(DE3)表达BLCAP融合蛋白并制备和鉴定其多克隆抗体。方法:构建原核表达重组质粒pET32a(+)-BLCAP并转化到宿主菌BL21中,诱导表达带有His标签的目的融合蛋白,经Ni2+亲和层析纯化回收后免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性和亲和性。结果:成功获得分子质量约为28 kU纯化的融合蛋白,免疫日本大耳白兔后得到抗BLCAP的多克隆抗体。ELISA测定显示抗体效价可达到1∶10 000。通过Western blot检测证明该抗体有较好的针对BLCAP蛋白的专一性。结论:重组质粒表达的BLCAP融合蛋白具有良好的抗原性。制备的特异性和效价良好的抗BLCAP的多克隆抗体,能够满足针对BLCAP免疫印迹和细胞免疫组化检测等实验要求,为今后深入研究BLCAP蛋白性质与功能提供了有用的实验工具。     

重组日本血吸虫极低密度脂结合蛋白的抗原性及诊断价值的研究

目的探讨重组日本血吸虫特异性极低密度脂结合蛋白(SVLBP)的抗原性及其诊断价值。方法SVLBP基因亚克隆人pQE-30表达载体，克隆菌在IPTG诱导下表达重组蛋白；非变性条件下制备克隆菌裂解液，用亲和层析法纯化重组蛋白；用Westem blot鉴定其抗原性；纯化SVLBP重组蛋白免疫家兔获得抗血清；以SVLBP重组蛋白为抗原，ELISA法检测血吸虫感染者血清及健康人血清。结果克隆菌在IPTG诱导下高表达SVLBP重组蛋白；该重组蛋白诱导家兔产生单特异抗体，抗体滴度为1：6400；SVLBP重组蛋白与血吸虫病人血清有较强的反应；以该蛋白为抗原检测36人份血吸虫感染者血清，阳性率为8313％，50人份健康人血清，假阳性率为2％(I/50)，10人份肺吸虫病人血清，1例阳性，交叉反应率为10％0／10)。结论SVLBP重组蛋白有较好的抗原性。以该重组蛋白为抗原检测日本血吸虫病患者血清中特异性抗体，敏感性和特异性均较高，具有一定的诊断价值。     

结核分支杆菌14KDa蛋白的基因克隆、表达、纯化及其抗原性的研究

目的基因克隆、表达、纯化结核分枝杆菌14KDa蛋白,研究其抗原性,评价其在血清学诊断中的价值。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增14KDa蛋白基因片断,将其插入到高效表达载体PET-22b（＋）上,构建重组质粒PET-22b（＋）/14KDa,重组质粒在大肠杆菌中由IPTG诱导表达,表达产物经金属离子鳌合亲和层析方法纯化,免疫印迹和酶联免疫吸附（ELISA）试验分析重组蛋白的抗原性。结果构建了具有正确基因序列的14KDa蛋白重组质粒,在大肠杆菌BL21（DE3）中以可溶性蛋白形式表达,重组蛋白的表达量占菌体蛋白的40.8%,经过一步金属离子鳌合亲和层析后得到纯度为94.3%的目的蛋白。免疫印迹试验结果表明该蛋白能与羊抗结核血清发生特异免疫结合反应。应用ELISA方法对结核血清参考品进行检测,敏感性和特异性分别为75.6%和96.0%。结论获得了能高效表达14KDa蛋白的大肠杆菌工程菌,目的蛋白以可溶性形式表达,该重组蛋白具有良好的免疫原性,可望成为结核血清学的诊断抗原之一。     

新基因ZNFD的克隆及其多克隆抗体的制备

目的:PCR扩增得到新基因ZNFD(Znf domain containing protein),构建pET32a-ZNFD原核表达载体,诱导蛋白表达及制备多克隆抗体。方法:通过PCR的方法克隆新基因ZNFD,选取部分抗原免疫原性较高的部分ORF序列,克隆到原核表达载体pET32a上,利用大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)表达系统表达ZNFD融合蛋白。纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过琼脂糖双向扩散实验和Western blot鉴定其效价和特异性。结果:经测序鉴定已成功克隆ZNFD基因。通过构建原核表达载体pET32a-ZNFD,在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中使用IPTG诱导表达,得到相对分子质量约为45 kD的融合蛋白。纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强的免疫特异性。结论:得到纯化的ZNFD蛋白,制备的多克隆抗体达到了一定的效价,且具有高特异性,为进一步研究ZNFD的功能奠定了实验基础。     

人sCR1克隆、真核和原核表达纯化及其多克隆抗体制备

的：原核表达人sCR1分子胞外区及其多克隆抗体制备。方法：提取人总RNA进行RT—PCR扩增合成cDNA,以cDNA为模板,构建重组表达质粒pET28a—sCR1。转化大肠杆菌中,用IPTG诱导表达重组人sCR1融合蛋白,将其作为免疫原制备兔多抗。采用ELISA法检测抗体效价,经免疫亲和层析法纯化后,进行SDS—PAGE鉴定分析。结果：在原核细胞巾高效表达人sCR1融合蛋白,经纯化复性后作为免疫原,免疫家兔,获得了高效价及特异性的兔抗人sCR1多克隆抗体,可特异地识别人sCR1蛋白。结论：纯化复性后的sCRI融合蛋白作为抗原免疫家兔,有较好的抗原性和免疫原性,成功地制备出兔抗人sCR1多克隆抗体,为进一步大量表达纯化人sCR1融合蛋白与临床免疫学检测方法的建立,也为深入研究sCR1生物学功能奠定了基础。     

颗粒酶B的表达纯化和鉴定

目的：克隆颗粒酶B(GraB)，构建GraB的原核表达载体，从而建立其原核表达体系，获得高效表达的重组GraB。方法：抽提人外周血淋巴细胞总RNA,进行RT-PCR克隆GraB cDNA，构建GraB原核表达载体，用限制性酶切和DNA测序进行鉴定；异丙基-1-硫代-β-呋喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表达产物。表达产物亲和层析纯化并用免疫印迹法鉴定，以GraB底物测定其活性。结果：表达产物以可溶性分子形式存在于菌体中，具有良好的抗原性和特异性，并能作用于GraB特异性底物。结论：建立了GraB原核表达系统。     

HIV-1 p15（Gag）基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的:构建HIV-1p15(Gag)原核表达载体,诱导蛋白表达及制备多克隆抗体。方法:用PCR的方法扩增编码p15(Gag)基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a( )中,利用大肠杆菌表达系统表达HIV-1p15蛋白,分别用His抗体和HIV阳性血清做western blot鉴定目的蛋白的免疫原性。纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA),细胞免疫组织化学法检测抗体滴度及其特异性。结果:原核表达载体pET28a( )-p15(Gag)成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,得到相对分子质量约20KD的p15(Gag)蛋白,经western blot鉴定正确。纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性。结论:得到纯化的HIV-1p15蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下病毒蛋白p15(Gag),为进一步研究HIV-1奠定了实验基础。     

幽门螺杆菌cagA蛋白的克隆表达与鉴定

目的　构建表达幽门螺杆菌 (Hp)毒素相关基因A蛋白 (cagA)的重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白 ,为检出幽门螺杆菌致病株和运用于临床检测Hp感染奠定基础。 方法　PCR扩增出编码毒素相关基因蛋白DNA片段后构建出重组质粒 pET -cagA ,并经质粒酶切筛选、DNA测序、IPTG诱导DE3 表达融合蛋白和Western blot予以证实。表达的融合cagA蛋白经过纯化和凝血酶酶切验证cagA蛋白抗原性。 结果　克隆的cagA核苷酸序列与GeneBank(AB116 74 4 )公布的序列相比较 ,同源性达 99.34% ,推定氨基酸序列同源性为 99.0 1%。SDS -PAGE和Western blot检测到带有His tag的约 4 0kD融合蛋白中表达。融合蛋白酶切后能与抗cagA人抗血清发生阳性反应。 结论　重组cagA的原核表达质粒构建正确 ,蛋白表达成功 ,具有反应原性     

恶性疟原虫复制蛋白PfRPA2的原核表达及多抗制备

目的克隆表达恶性疟原虫复制蛋白PfRPA2亚基,制备多抗,为该蛋白的功能研究奠定基础。方法 PCR扩增目的基因片段,克隆到表达载体pGEX-KG中,构建PfRPA2/pGEX-KG原核表达载体,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物,谷胱甘肽柱纯化蛋白,Westernblot检测其抗原性,以纯化的GST-PfRPA2免疫小鼠,制备抗PfRPA2的多抗,间接ELISA法检测鼠血清效价,Westernblot鉴定多抗特异性。结果成功构建了重组PfRPA2/pGEX-KG原核表达质粒,并在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达,纯化表达产物,制备抗PfRPA2的鼠多抗,效价为10-7,Westernblot证实此抗体可识别恶性疟原虫内与PfRPA2蛋白位置对应的特异性条带。结论恶性疟原虫复制蛋白PfRPA2亚基在大肠杆菌中获得可溶性高效表达,纯化表达产物能诱导小鼠生产能识别天然蛋白的特异性抗体。     

人肿瘤蛋白D52重组融合蛋白的原核表达及特性鉴定

目的:表达人肿瘤蛋白D52(human tumor protein D52,hTPD52)的重组融合蛋白,并对该蛋白的生物学特性进行鉴定?方法:RT-PCR扩增乳腺癌MCF-7细胞中的hTPD52基因并克隆于pMD18-T载体中,测序鉴定序列正确后,分别插入pET-32a?pGEX-4T-2和pET-28a 3种表达载体中?重组质粒经酶切鉴定?序列分析正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),选择最佳表达载体和表达条件进行大量表达,表达产物经His柱亲和纯化和超滤浓缩后,应用Dot blot?Western blot鉴定纯化蛋白的特性?结果:正确扩增出了hTPD52基因,鉴定其为isoform 3型?用pET-32a-hTPD52重组表达载体能够大量表达可溶性的hTPD52-Trx融合蛋白,Dot blot显示表达的融合蛋白能和抗hTPD52的抗体结合,SDS-PAGE和Western blot显示表达的融合蛋白分子质量约为44 ku,去除Trx后仍能够与特异性抗体结合?结论:成功制备hTPD52重组融合蛋白,并证明原核表达的hTPD52保留了原有的抗原结合活性?     

呼吸道合胞病毒NS1基因原核表达及其免疫原性分析

目的:原核表达呼吸道合胞病毒(RSV)非结构NS1蛋白,并对其免疫特性进行研究.方法 采用PCR技术获得NS1基因,将其插入pET41a(+)载体上,导人大肠杆菌后诱导表达;利用GST亲和层析柱对诱导表达的NS1蛋白进行纯化,免疫动物制备抗体,Western blot法鉴定抗体的特异性.结果 重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测序完全正确,经IPTG诱导后融合蛋白在大肠杆菌BL21-DE3中得到高效表达,表达产物经超声破碎和GST亲和层析纯化获得重组蛋白,分子量约42 000 Mr,以抗NS1蛋白的多克隆抗体为一抗进行Western blot检测,结果只有RSV感染细胞的样品在15 000 Mr处有特异性带显示,其他病毒感染的细胞和阴性对照没有相应条带.结论 NS1基因得到高效表达,免疫制备得到的抗体与RSV感染细胞有特异性反应,与其他常见呼吸道病毒感染细胞无交叉免疫反应.