柱孢鱼腥藻的铁蛋白与棕色固氮菌的钼铁蛋白的交叉互补作用

纯化的柱孢鱼腥藻铁蛋白能够与棕色固氮菌的钼铁蛋白有效地交叉反应,展现较高的活性。此异源交叉反应的乙炔还原比活及放氢比活,分别是蓝藻同源互补比活的83.8及66．7％。比较藻铁蛋白与菌钼铁蛋白异源交叉反应及藻固氮酶组分之间的同源反应的动力学特点时发现,铁蛋白对钼铁蛋白的最佳克分子比数前者(异源交叉反应)较后者(藻同源反应)为高,前者为5,后者为1;但反应的时间进程两者差别不大。     

蓝藻固氮酶钼铁蛋白的研究

改进了蓝藻固氮酶的分离、提纯方法。首次用小型厌氧聚丙烯酰胺凝胶制备电泳法,代替常用的层析法,获取了电泳纯的蓝藻固氮酶钼铁蛋白,简化了程序,缩短了实验周期。SDS凝胶电泳和分子筛凝胶过滤测定分子量结果表明,钼铁蛋白分子量为360,000,由4个分子量为90,000的同一类型亚单位构成。每个钼铁蛋白分子含1个钼,18个铁和3290个氨基酸残基。其中酸性氨基酸占优势。研究了柱孢鱼腥藻(Anabaena cylindrica)固氮酶粗提物和钼铁蛋白的某些特性,其结果是:米氏常数为3.33×10~(-3)大气压乙炔,等电点为5—5.5。紫外、可见光谱与其它固氮生物的类似。盐对蓝藻固氮酶较之对其它固氮生物的固氮酶有更大的抑制作用。     

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白中含钼铁活性小分子组分的解离

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白结晶,经酒石酸解离后得到一个含钢铁小分子组分,与棕色固氮菌突变株uw_(45)无细胞提取液的重组比活为6.8nM Mo natom~(-1) min~(-1)。它是由二种物质组成的混合物,其分子量分别为2100和1850道尔顿,分子量为2100道尔顿的成分含钼铁。酒石酸处理后的沉淀,再用N—甲基甲酰胺抽提得到的含钼铁组分具有恢复突变株uw_(45)乙炔还原活性的能力。经纸层析鉴定与用Shah法制备的铁钼辅因子相类似。由于Shah和Smith法制备的两种铁钼辅因子还原乙炔和氰化钾的比活不同,而且分子量也有大小,说明这两种铁钼辅因子结构可能不尽相同。     

固氮蓝藻与棕色固氮菌固氮酶组分的交叉互补功能

本文报告了藻菌之间固氮酶组分的交叉互补试验。初步结果证明：固氮蓝藻(Anabaena azotica水生686)的钼铁蛋白与棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)的铁蛋白之间存在着明显的互补功能。但这种蓝藻的铁蛋白在非细胞形态下很不稳定,易于失活。本实验为不同生理类型和不同进化程度的固氮生物之间固氮酶组分的交叉互补研究提供了新的资料。     

不同底物与固氮酶及其钼铁蛋白相互作用的荧光光谱分析

 本文研究了不同底物(N_2,H_2,N_2O,NaN_3,C_2H_2)对棕色固氮菌固氮酶及其钼铁蛋白荧光光谱的影响。结果表明,上述底物均能络合在钼铁蛋白及固氮酶上,但络合程度不同,从而为固氮酶系统有多个不同的底物络合中心,底物络合中心在钼铁蛋白分子上,铁蛋白对钼铁蛋白有变构作用,提供了光谱学证据。     

棕色固氮菌固氮酶铁蛋白特性的研究(三)

应用亚铁螯合剂研究了棕色固氮菌固氮酶铁蛋白中Fe_4S4_簇与Mg·ATP的关系。未变性铁蛋白与螯合剂无反应。Mg·ATP和PCMB促进铁蛋白中的铁与螯合剂的反应。Mg·ADP抑制Mg·ATP的作用。加入Mg·ATP或PCMB后1小时内有75％以上的铁被螯合,20小时内几乎全部被螯合(97％以上)。单独的ATP,ADP,Mg~( )无作用。氧钝化铁蛋白中铁能直接与螯合剂反应,Mg·ATP或PCMB浓度与反应速度的关系符合S型动力学。用Hill作图法得到斜率的为2,说明在铁被螯合前Fe_4S_4簇上(或附近)的两个位置已参与反应。Brdicka反应和羟甲基化作用结果表明钼铁蛋白与铁蛋白巯基二者的相互作用。     

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白两种聚合体的研究

 棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白八聚体相当于两个钼铁蛋白四聚体的聚合体。在细胞生长过程中,胞内钼铁蛋白两种聚合体的相对含量出现规律性变化:在对数期,细胞固氮酶比活力成上升趋势,而钼铁蛋白主要以高活力的四聚体形式存在;在对数期结束至稳定期,细胞固氮酶比活力下降至一个低水平的稳定值,此时的钼铁蛋白基本上为八聚体形态。在细胞固氮生长时,向培养基中加入过量氨可明显地导致钼铁蛋白由四聚体向八聚体的转化。我们推断,生长过程中胞内钼铁蛋白聚合态的变化可能是调节固氮酶活力的一种方式。胞外,钼铁蛋白的两种聚合态可以相互转化。     

固氮蓝藻与棕色固氮菌固氮酶组分的交叉互补功能

本文报告了藻菌之间固氮酶组分的交叉互补试验。初步结果证明:固氮蓝藻(Anabacnaazotica水生686)的钼铁蛋白与棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)的铁蛋白之间存在着明显的互补功能。但这种蓝藻的铁蛋白在非细胞形态下很不稳定,易于失活。本实验为不同生理类型和不同进化程度的固氮生物之间固氮酶组分的交叉互补研究提供了新的资料。       

棕色固氮菌固氮酶铁蛋白的研究(四)

应用荧光探剂——荧光醋酸汞和荧光胺研究了棕色固氮菌固氮酶的两种蛋白组分与MgATP和MgADP的关系。实验确证该菌钼铁蛋白不能与MgATP和MgADP络合,而铁蛋白则能。每分子铁蛋白络合2个分子MgATP,但至少是络合2个分子MgADP,反应的部位是在铁蛋白的巯基上。MgATP和MgADP与铁蛋白络合后,引起铁蛋白构型变化,使铁蛋白中可与荧光胺反应的氨基量增加。MgATP和MgADP二者与铁蛋白作用后所得结果相近似。在没有MgATP存在条件下,钼铁蛋白仍能与铁蛋白相互作用,并在巯基部位上产生变化。对于氨基也有影响。     

铁钼辅因子激活氧钝化钼铁蛋白的初步研究

棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)固氮酶钼铁蛋白氧钝化后,未断裂出任何含钼、铁原子的断片。用有机溶剂从钼铁蛋白中提取得到的铁钼辅因子(FeMoCo)可以激活被氧钝化了的钼铁蛋白,使其还原乙炔能力得到部分或完全恢复。这种激活作用的效率随着钼铁蛋白氧钝化程度的加深而降低。初步结果表明,氧钝化的钼铁蛋白中最先受到损伤的可能是 FeMoCo。如果氧钝化程度进一步加剧,其它部分也可能受到损伤。     

钼铁蛋白铁钼辅因子的有机组分对其功能的影响

棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)固氮酶的钼铁蛋白经邻菲啰啉在厌氧或有氧环境中处理后,变为 P-cluster 单一缺失或 P-cluster 和 FeMoco 同时缺失的失活钼铁蛋白。含柠檬酸盐或高柠檬酸盐的重组液都使这两种失活蛋白能恢复固氮酶重组的 H~ 和 C_2H_2还原活性,活性恢复程度随反映钼铁蛋白中金属原子簇含量变化的圆二色和磁圆二色谱及金属含量的恢复程度的提高而提高,但它们固 N_2能力的恢复程度则不相同:P-cluster 单一缺失的蛋白用两种重组液重组后均可恢复其固 N_2能力,而 P-cluster 和 FeMoco 同时缺失的蛋白,只有用含高柠檬酸盐的重组液重组才恢复其固 N_2能力,表明含不同有机组分的重组液所组装的 P-cluster 均与天然状态相同,只有含高柠檬酸盐的重组液所组装的 FeMoco 才与天然状态相同,从而证明高柠檬酸盐是 FeMoco 的必需的有机组分。     

高度缺失金属原子簇的钼铁蛋白的制备及其重组

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白与邻菲罗啉厌氧保温时,尿素可使钼铁蛋白丢失的Ｆｅ原子数目显著增加,在有过量Ｎａ２Ｓ２Ｏ４存在时,每个蛋白分子失去的Ｆｅ原子数猛然增至２６－２８个,经Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５柱层析得到的蛋白已失去８５％的乙炔还原活性,而蛋白回收率仍可达６０％。与含Ｍｏ重组液重组后,这种失活蛋白的紫外－可见圆二色谱、凝胶电泳图谱和乙炔还少在性均有所恢复,结果表明,尿素可使厌氧钼铁蛋白的ＦｅＭ     

固氮酶

指固氮生物中对固定空气中分子氮并将其转变成氨起特殊催化功能的酶蛋白质。已从16种不同类型固氮生物中分离到固氮酶,它可分为两种独立的酶蛋白:(1)含钼和铁,称钼铁蛋白;(2)含铁,称铁蛋白。一般认为前者是络合和还原氮的中心,后者是电子活化中心。两者单独存在时不能固氮,只有合起来才能重组固氮活性。固氮酶(尤其是铁蛋白)对氧和摄氏零度左右的低温很敏感,易于失活。由于两种蛋白重组固氮活性时的确切比例尚不清楚,加上它们的均一制剂又未得到,所以对整个固氮酶的分子量还无法判断。目     

用酒石酸解离棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白获得的含钼铁组分

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白结晶,经处理先后出现一个与福林试剂呈颜色反应的洗脱峰Ⅰ和一个与茚三酮试剂呈颜色反应的洗脱峰Ⅱ。洗脱峰Ⅰ、Ⅱ均含有钼和铁。钼和铁的洗脱峰位基本上与蛋白或肽的洗脱峰位相符合。 两个洗脱峰中的成分都能激活棕色固氮菌突变株UW45无细胞抽出物的非活性组分Ⅰ,比活分别为17.8和6.8毫微克分子乙烯/分/毫微克原子钼,并能在硼氢化钾存在下自身催化还原乙炔,比活分别为16.9和50.9毫微克分子乙烯/分/毫微克原子钼。 峰Ⅰ与峰Ⅱ的组成不同,峰Ⅰ是一种组分,峰Ⅱ是两种组分的混合物。峰Ⅰ组分是不同于固氮酶钼铢蛋白的一种蛋白质。洗脱峰Ⅰ组分的分子量是5000道尔顿,洗脱峰Ⅱ两种组分的分子量分别是2100和1850道尔顿。经测定,峰Ⅰ组分和峰Ⅱ中分子量为2100道尔顿的组分含有钼、铁。因此,通过酒石酸处理可以从上清液中得到两种含钼铁的组分。这两种组分的红外吸收光谱也是明显不同的。 酒石酸处理后的沉淀再用N-甲基甲酰胺抽提获得的组分,具有恢复棕色固氮菌突变株UW45乙炔还原活性的能力。经纸层析鉴定,与Shah法制备的铁钼辅因子相类似。     

棕色固氮菌不固氮变种UW45与固氮酶钼铁蛋白铁钼辅因子重组的某些特性

以UW45抽提液的DEAE-纤维素柱层析的0.15M NaCl或0.25M NaCl洗出液与Smith法或Shah法制备的铁铝辅因子重组,则0.25 M NaCl洗出液的重组对乙炔还原的活性远较0.15 M NaGl的为高。0.15 M NaGl的洗出液较0.25 M NaCl洗出液的组分明显不纯。不全钼铁蛋白与铁钼辅因子和铁蛋白重组后能还原基质氰化钾,但对分子氮或迭氮化钠的还原却较微弱甚至不还原。铁钼辅因子按Smith和Shah法制备,其分子量范围分别为低于1000D和接近1500D。由于Smith和Shah法两种铁钼辅因子还原乙炔和氰化钾的比活不同,电泳图谱有差异、分子量又有大小,因此这两种铁钼辅因子的分子结构可能不尽相同。     

含铬重组液激活部分缺失金属原子簇的钼铁蛋白的研究

棕色固氮菌（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）固氮酶钼铁蛋白经邻菲口罗啉和Ｏ２ 处理后,变为部分缺失ＦｅＭｏｃｏ 和Ｐ－ｃｌｕｓｔｅｒ的失活蛋白。与由Ｋ２ＣｒＯ４、高柠檬酸铁、Ｎａ２Ｓ和二硫苏糖醇组成的重组液保温后,处理蛋白对乙炔和质子还原的活性都得以显著恢复;然而,它的吸收光谱和圆二色谱虽有明显恢复,但仍与还原钼铁蛋白有所不同。这表明,激活蛋白中也许存在功能与钼铁蛋白相似,而结构则有所差异的含铬（ＣｒＦｅ）蛋白     

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白纯净铁钼辅因子的制备和性质

建立了以挥发性酸碱(TFA/NH_4OH)和NH_4OH碱化的NMF从棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白分离提取纯净铁钼辅因子(FeMo—co)的方法。得到了纯净FeMo-co的NMF制剂,从而证明了Tris、ClNa~ 、柠檬酸、HPO_4~(-2)、S_2O_4~(2-)以及氨基酸残基不为FeMo—co的有效分离和结构稳定所必需。制备的纯净FeMo—co的Fe/Mo比为8,比活为230nMC_2H_4/min/MoMn。由于分离制备的FeMo—co制剂除抽提溶剂NMF外不含任何其他成分,所以是进行FeMo—co结晶和结构研究的理想材料。     

锰对部分缺失金属原子族的固氮酶钼铁蛋白的重组作用

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白经邻菲罗啉的Ｏ２处理后,变为部分缺失Ｐ－ｃｌｕｓｔｅｒ和ＦｅＭｏｃｏ的失活蛋白、经与由ＫＭｎＯ４、高柠檬酸铁、Ｎａ２Ｓ和二硫苏糖醇组成的重组液保温后,重组蛋白的吸收光谱和对Ｃ２Ｈ２、Ｈ＋和Ｎ２的还原活性都恢复至与还原钼铁蛋白相似的状态,而它的α－螺旋度和在３８０－５５０ｎｍ,６２０－６７０ｎｍ的ＣＤ谱虽有明显的恢复,但仍与还原钼铁蛋白有所不同。表明：（１）重组蛋白液既含有在     

含铬重组液激活部分缺陷失金属原子族的钼铁蛋白的研究

棕色固氮菌固氮酶相铁蛋白经邻菲罗啉和Ｏ２处理,变为部分缺失ＦｅＭｏｃｏ和Ｐ－ｃｌｕｓｔｅｒ的失活蛋白。与由Ｋ２ＣｒＯ４、高柠檬酸铁、Ｎａ２Ｓ和二硫苏糖醇组成的重组液保温后,处理蛋白对乙炔和质子还原的活性都得以显恢复,然而,它的吸收光谱和圆二色谱虽有明显恢复,但仍与还原钼铁蛋白有所不同。这表明,激活蛋白中也话存在功能与钼铁蛋白相似,而结构则有所差异的含铬蛋白。     

棕色固氮菌固氮链中的能量转化

应用Fld_(SR)天然荧光和1,5—Br—AEDANS及5—IAF荧光探针偶标记铁蛋白和钼铁蛋白作荧光测定。Fld在与铁蛋白络合时所损失能量为铁蛋白所接受。同样,铁蛋白与钼铁蛋白络合时也有能量转移现象。铁蛋白与MgATP形成复合物后仍能将能量转移给钼铁蛋白,铁蛋白与钼铁蛋白络合物间荧光标记基团距离为35～58A,铁蛋白·MgATP与钼铁蛋白间荧光标记基因距离为38～63A。