大肠杆菌β-D-半乳糖苷酶的纯化与鉴定

大肠杆菌β-D-半乳糖苷酶的两种纯化方法:DEAE A50和sepharose 6B两次层析法、与底物类似物的亲和层析法均可获高纯度酶,后者方法简便,适于大量制备。酶在PAGE上显示六条区带;主区带与其余三条活性带迁移率分别为13.5,7.5,6.3和4.6mm。酶主区带分子量130000。酶与其相应抗体的免疫电泳呈两条沉淀线。酶米氏常数为4.348×10^-4M。其SH基含量18.5个/克分子蛋白。酶悬液于4℃保存稳定性较好。活力500u/mg蛋白。可达美国Sigma     

应用QAE Zetaprep盘层析法从少量标本中提纯单克隆抗体

用QAE Zetaprep盘(LKB公司提供)层析法(简称QAE Z-P法)纯化抗-乙型肝炎病毒表面抗原(抗-HBsAg)亚型决定簇杂交瘤细胞株产生的McAb,与传统应用的DEAE纤维素柱层析法比较(两种方法纯化的McAb均用RIA和ID法测定其抗体滴度,Folin酚法测定蛋白含量),结果,采用QAE法纯化,整个过程只需50分钟左右,而且样品不需先经盐析处理,层析后出现两个蛋白峰,第一峰为IgG,免疫扩散试验中出现一条清晰的IgG沉淀线;第二峰为杂蛋白,无拖尾现象。用传统的DEAE-52层析法纯     

重组hPRL-1的表达纯化及其理化和酶学性质研究

目的:表达纯化hPRL-1重组蛋白,分析其理化性质及酶学特性。方法:热激法将重组pET15b质粒转化入E.coli BL21中,IPTG诱导表达出His-tagged hPRL-1蛋白。使用Ni-NTA亲和层析法结合Mono Q离子交换层析法纯化。用SDS-PAGE法和Western Blot法进行表达情况的定性定量分析,并使用HPLC法鉴定蛋白纯度,计算出蛋白分子量,圆盘等电聚焦电泳分析重组蛋白等电点。比较分析以pNPP、4-MUP和DiFMUP为底物时的酶促反应动力学。同时以pNPP为底物测定酶的最适pH值;以4-MUP为底物测定酶的最适温度,分析探讨缓冲液离子强度与蛋白酪氨酸酶通用抑制剂钒酸钠对酶活力的影响。结果:以亲和层析和离子交换层析结合,可以纯化得到纯度约为95%的蛋白。测得蛋白分子量为24.54kD,等电点为9.11。以pNPP、4-MUP和DiFMUP为底物时Km分别为3720μmol/L,130μmol/L和50μmol/L。酶的最适pH值为7.6,最适温度为34℃。结论:纯化所得蛋白为目的蛋白hPRL-1;两步纯化相结合可以得到纯度较高的蛋白;三种底物特异性依次为DiFMUP>4-MUP>pNPP。     

重组人骨形态发生蛋白-2抗体的制备及纯化

骨形态发生蛋白-2是骨科研究领域的重要生物蛋白。用重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP₂)与BSA连接成复合物作为免疫原,免疫家兔制备出多克隆抗血清。分别用免疫沉淀法和Sepharose4B-BSA反向免疫亲和吸附法去除抗血清中载体BSA抗体。用盐析法和蛋白层析法纯化出抗rhBMP₂抗体。研究发现,家兔产生高效价抗体的最佳时间为14-16周,从rhBMP₂抗体的特异性、相对纯度及回收率综合分析,免疫沉淀法去除BSA抗体优于反相亲和吸附法。     

离子交换层析初步分离大鼠肝蛋白水解酶、ADAMs、ACP、AKP和PCNA

用DEAE 离子交换层析法分离 2 /3肝切除 ( partialhepatectomy ,PH)后恢复 4、 3 6和 14 4h的大鼠再生肝及正常肝的蛋白水解酶、ADAMs、ACP、AKP和PCNA ;用SDS PAGE、Western blot、酶复性电泳等方法 ,分析了它们在不同洗脱段中的分布及活性变化 ,为分离与肝再生有关的蛋白 (酶 )提供了资料。     

Scytovirin在大肠杆菌中的可溶性表达

目的:获得Scytovirin(SVN)蛋白及其多克隆抗体.方法:按照NCBI上公布的SVN基因序列设计合成引物,合成SVN基因,构建pET32c-SVN原核表达重组质粒,经限制性酶切分析、DNA序列测定插入片段正确;将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达;用离子交换层析法及金属亲合层析法纯化蛋白,采用Tris-Tricine系统分析;以经过纯化的蛋白为抗原免疫白兔,制备SVN多克隆抗体.结果:对表达产物进行了分离纯化,SVN纯度达到91%;用纯化的样品制备了多克隆抗体,抗血清效价为1∶102 400.结论:SVN在大肠杆菌表达系统中获得了高效可溶表达,并制备了其多克隆抗体,为进一步深入研究SVN提供了材料.     

免疫亲和层析法纯化T_4RNA连接酶

本文描述了一种新的、简化了的纯化T_4RNA连接酶的方法——免疫亲和层析法.利用这种纯化方法得到的酶,经SDS-凝胶电泳,得到一条主带。将此酶与~(32)pCp及CpGpGpA(或tRNA)一起进行连接反应,未见到RNase杂酶的降解作用。用此方法制备的酶,可用于确定顺序的核酸的合成。     

重组蓖麻毒素A链蛋白的可溶性表达、纯化与抗原性分析

用PCR方法从克隆质粒pUC19-RTA中扩增出蓖麻毒素A(RTA)链基因,序列分析正确后,亚克隆到原核表达质粒pET-His中,构建重组表达质粒pET-HisRTA,再转化到E.coliBL21(DE3)plysS中获得表达工程菌株BL21/pET-HisRTA。该工程菌在30℃经0.4mmol／LIPTG诱导4h后获得可溶性表达的目的蛋白,约占菌体总蛋白的18.45％,SDS-PAGE分析显示表达的蛋白区带与RTA相对分子量相符,约32kDa左右。表达产物经Ni-NTA亲和层析法一步纯化,蛋白纯度约达97.53％,并可得到约18mg/L重组RTA蛋白。Western印迹和间接ELISA结果证明,重组RTA蛋白与抗天然蓖麻毒素多抗可发生特异性的抗原抗体反应,具有良好的抗原性,这为制备RT特异性抗体及建立RT的检测方法奠定了基础。     

胶体金免疫层析法视黄醇结合蛋白检测试剂对肾小管功能损伤的诊断价值评价

目的:对胶体金免疫层析法的视黄醇结合蛋白(RBP)检测试剂诊断肾小管损伤的价值进行评价。方法:选择上海柏纳生物技术有限公司生产的视黄醇结合蛋白检测试剂盒(胶体金免疫层析法)与上海太阳生物技术有限公司生产的RBP含量测定试剂盒(酶联免疫法)进行对比试验,分别对临床选取的病例组和对照组的尿液样本进行检测。参考临床单位诊断标准,酶联免疫法结果浓度≥300ng/mL为阳性,<300ng/mL为阴性;胶体金免疫层析法检测结果检测线显色为阳性,不显色为阴性。对两组检验结果进行Kappa一致性检验,分析两种检测方法诊断结果的一致性,同时以临床通用诊断方法为参考,计算胶体金免疫层析法诊断肾小管功能损伤的灵敏度和特异度。结果:两种检测方法的诊断结果一致性良好(市一医院:K=0.9070,95%CI:0.8277～0.9863,P<0.01;市六医院:K=0.9391,95%CI:0.8714～1.000,P<0.01)。胶体金方法诊断肾小管损伤的灵敏度和特异度,市一医院:灵敏度=100%,精确95%CI为:92.45%～100.00%;特异度=91.80%,精确95%CI为:81.90%～97.28%;市六医院:灵敏度=100%,精确95%CI为:91.40%～100.00%;特异度=95.00%,精确95%CI为:86.08%～98.96%。结论:胶体金免疫层析法的视黄醇结合蛋白检测试剂与已批准上市的试剂等效,对肾小管功能损伤的诊断具有重大应用价值。     

免疫吸附亲和层析法提纯抗原、抗体——甲种胎儿蛋白的純化

亲和层析法是利用生物高分子化合物特有的功能专一性,使可逆地与其相对应的固相配基结合,而将生物高分子从其它杂质中分离出来的一种方法。目前已应用于蛋白质、酶、核酸、病毒、抗原和抗体等的提纯。把抗原或抗体用共价键联结到固相载体上,用以分离和纯化相应的抗体或抗原的方法称为免疫吸附法。例如,血清甲种胎儿蛋白(AFP)与白蛋白     

以核糖体蛋白L7/L12为分子标志物精准检测肺炎链球菌的研究

目的:以核糖体蛋白L7/L12为标志物,探索一种胶体金免疫层析法快速检测肺炎链球菌的方法。方法:分析核糖体蛋白L7/L12基因序列,构建原核表达载体,表达纯化重组蛋白,免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体;利用无标记分子相互作用仪检测抗原抗体亲和力;以双抗夹心法研制胶体金免疫层析检测试纸条,并对其特异性、敏感性及稳定性进行验证分析。结果:筛选得到两株高效分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,两种单克隆抗体均与抗原有高的亲和力并且无竞争,制作的试纸最低检出限为1. 0×105CFU/ml;其与肺炎链球菌有特异性反应,而与其它9种常见呼吸道病原菌均无交叉反应;试纸条在25℃下保存12个月仍具有良好的重复性和稳定性。结论:RP-L7/L12可作为肺炎链球菌的检测标志物,以其单抗制备的胶体金免疫层析试纸可适用于肺炎链球菌的快速检测。     

转基因玉米中植酸酶蛋白免疫亲和纯化体系的建立

为深入研究转基因玉米所表达的植酸酶蛋白的酶学性质,评价重组蛋白的致敏性和饲用安全性,必须获得高纯度植酸酶蛋白.利用识别4个不同表位的单克隆抗体制备了植酸酶蛋白亲和层析体系.结果显示,通过80％硫酸铵沉淀植酸酶蛋白粗提液初步浓缩目的蛋白后,再经过透析去除高浓度盐离子,进而通过免疫亲和层析可获得在SDS-PAGE胶上条带单一的植酸酶蛋白,比活可达470.99 U/mg.同时,将上述免疫亲和层析法对植酸酶的纯化效果与离子交换层析方法进行了对比,结果表明免疫亲和层析法具有稳定、快速和纯化产物比活高等优势,所获得的目的蛋白满足各种检测要求,优于离子交换层析方法.     

木霉β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化

目的:对木霉菌株LE02所产β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化方法进行研究。方法:粗酶液分别用硫酸铵、乙醇和丙酮进行沉淀,再用DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析进一步分离纯化,并用SDS-PAGE法测其分子量。结果:硫酸铵分段盐析法沉淀酶蛋白的效果优于乙醇和丙酮沉淀;盐析得到的酶蛋白经透析浓缩后,再经DEAE-Sepharose CL-6B层析分离,可得到单一酶蛋白,总酶活回收率达78.71%,比酶活达到689.9U/mg,提高了53.74倍,经SDS-PAGE法测得该β-1,3-葡聚糖酶的分子量为80.137kDa。结论:采用硫酸铵分段盐析和离子交换层析法可获得电泳纯的β-1,3-葡聚糖酶,且酶活回收率高。     

小胸鳖甲胞外铜锌超氧化物歧化酶重组蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

超氧化物歧化酶(SOD)是清除生物体内超氧阴离子自由基的主要抗氧化酶家族。基于原核表达系统,成功表达了拟步甲科Tenebrionidae小胸鳖甲Micordera punctipennis胞外铜锌SOD的重组蛋白(本文定义为Trx-His-MpecCu/Zn-SOD)。经Ni 2+亲和层析法纯化重组蛋白后,研究了重组蛋白的部分酶学性质。通过足垫加皮下注射法3次免疫小鼠后,分别用ELISA和Western blot的方法检测抗体效价和抗体特异性。结果表明,重组蛋白主要以包涵体形式存在,纯化后的重组蛋白浓度为1.33 mg·mL^-1,酶活力为27.52 U·mg^-1。Trx-His-MpecCu/Zn-SOD在25~45℃具有比较稳定的酶活性,在35℃最高,同时表现出比较广泛的酸碱耐受性(pH3~12),最适pH为9.0,表明重组蛋白的酶活性相对比较稳定。蛋白免疫法制备的鼠抗MpecCu/Zn-SOD多克隆抗体滴度高于1∶819 200。Western blot结果显示,该抗体能免疫结合重组蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD和小胸鳖甲体内天然MpecCu/Zn-SOD,但不能与黄粉虫Tenebrio molitor的总蛋白结合,说明制备的抗体效价较高且特异性较好。本研究结果为小胸鳖甲ecCu/Zn-SOD功能的深入研究奠定了基础。     

小鼠Prune蛋白DHH结构域的原核表达及多克隆抗体的制备

[目的]表达、纯化小鼠Prune蛋白DHH结构域(m-Prune D),并制备多克隆抗体。[方法]生物信息学方法分析m-Prune D氨基酸序列;PCR扩增目的基因m-Prune D,克隆入原核表达载体p ET28a(+);IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE和Western Blot鉴定蛋白表达,亲和层析法纯化蛋白;用纯化的重组m-Prune D免疫小鼠制备多克隆抗体;Western Blot检测多克隆抗体特异性。[结果]PCR成功扩增m-Prune D基因,双酶切及测序结果表明成功构建m-Prune D原核表达载体,SDS-PAGE和Western Blot鉴定表明成功表达约25 k Da的重组蛋白。纯化蛋白免疫小鼠后抗体滴度最高可达1∶25 600,所制备的多克隆抗体可特异性识别原核和真核细胞中DHH结构域蛋白。[结论]在E.coli中成功表达小鼠Prune蛋白DHH结构域,制备了多克隆抗体血清,可用于Prune蛋白生物学功能的进一步研究。     

EpCAM蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备

目的:原核表达EpCAM蛋白并制备抗EpCAM特异性单克隆抗体,初步鉴定相应单克隆抗体的特性。方法:PCR扩增EpCAM基因胞外区,将目的基因亚克隆至载体pET-28a(+),转化至大肠埃希菌株BL21,IPTG诱导表达,组氨酸亲和层析法纯化表达产物。纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,将成功免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合,经ELISA筛选得到分泌特异性抗EpCAM的单克隆抗体的细胞株,免疫BALB/c小鼠进一步制备相应的单克隆抗体,并通过Western blot(蛋白质印记)和FACS(流式细胞分析)鉴定单抗的特异性及生物学活性。结果:成功构建重组表达载体pET28a-EpCAM并在大肠杆菌中获得表达,经His-tag亲和层析法获得纯化的EpCAM重组蛋白。EpCAM重组蛋白免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合、筛选,获得两株稳定分泌EpCAM抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4B2、2F2并免疫BALB/c小鼠获得相应的单克隆抗体。Western blot结果显示4B2腹水纯化所得单抗能够识别FaDu细胞系(人咽鳞癌细胞)中的EpCAM蛋白,但2F2未能识别FaDu细胞中的变性的EpCAM蛋白。FACS结果显示两者均能和FaDu细胞中天然的EpCAM蛋白结合。讨论:成功制备了抗EpCAM的单克隆抗体,并能够识别人咽鳞癌细胞系FaDu中表达的EpCAM,为进一步研究EpCAM抗体在肿瘤治疗中的作用提供基础。     

梅毒螺旋体重组抗原的表达及在梅毒血清学诊断中的应用

目的：克隆、表达梅毒螺旋体（Treponema pallidum, Tp）膜蛋白TpN47、TpN17、TpN44.5和TpN15,建立双抗原夹心ELISA法,探讨其在梅毒血清学诊断中的应用。方法：应用聚合酶链反应法（PCR）从Tp全基因组中扩增4个目的片段,克隆到载体pET-HT-JKM中,在BL21(DE3)plysS菌中诱导表达,Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白,辣根过氧化物酶标记,双抗原夹心酶联免疫吸附法检测人血清中的特异性IgM和IgG抗体。结果：成功表达了4种重组蛋白用作ELISA包被和酶标抗原检测国家Tp参比血清,特异性和灵敏度均为100％;检测385份临床血清样本,结果与TPPA法相比符合率达到99％（P＜0.01）,灵敏度和特异性分别为98.2%（162/165）和99.5%（219/220）。结论：表达的4种重组抗原具有很好的生物活性,为理想的梅毒的血清学诊断用抗原。以这4种表达蛋白为基础建立的双抗原夹心ELISA法灵敏度高,特异性好,而且方法简单,结果客观,易于自动化操作,值得临床大力推广。     

汉坦病毒结构蛋白的鉴定及其应用

对差速离心纯化的汉坦病毒R84-1毒株进行了SDS-PAGE和免疫印迹试验。发现有67k和43k两条蛋白区带能与汉坦病毒抗体起反应。经单克隆抗体鉴定,67k多肽可能属病毒囊膜蛋白,43k多肽未定。用免疫印迹法对出血热患者进行检测,初步证明野鼠型感染者具有上述两种蛋白抗原的抗体,大鼠型患者仅具有67k蛋白的抗体,这对出血热患者血清学分型有重要意义。     

人抗酶抑制因子-1的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

原核表达纯化人抗酶抑制因子-1((antizyme inhibition factor-1,AZIN1),制备并鉴定抗AZIN1多克隆抗体。p ET-28a/AZIN1表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,IPTG诱导蛋白表达,利用Ni-NTA树脂于变性条件下亲和层析纯化人AZIN1蛋白。将重组AZIN1蛋白用作抗原免疫BALB/c小鼠以制备多克隆抗体,ELISA检测抗AZIN1抗体效价,Western bloting、细胞免疫荧光、细胞免疫化学方法检测抗体的应用。结果显示,重组p ET-28a/AZIN1表达质粒经酶切及测序鉴定构建正确。细菌内重组AZIN1蛋白可被IPTG诱导表达并以包涵体的形式存在。用亲和层析法能有效纯化原核表达的AZIN1蛋白,该蛋白在小鼠体内能够诱导抗AZIN1特异性抗体产生,血清效价达到1640 000。制备抗体能够特异性识别和结合人及小鼠瘤细胞中表达的AZIN1蛋白,并可有效用于AZIN1的Western blotting、细胞免疫荧光和细胞免疫化学分析。成功原核表达和纯化了人AZIN1蛋白并制备了抗AZIN1多克隆抗体,为深入研究AZIN1在调控细胞增殖及在疾病防治中的作用提供了研究基础。     

血清学诊断中结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶的应用

[目的]在原核系统中表达结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate car-boxykinase PEPCK),并研究该蛋白在诊断结核病人血清抗体中的应用价值.[方法]应用基因重组技术表达重组蛋白结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶,经亲和层析法纯化表达产物.用表达的重组蛋白免疫小鼠,研究其免疫学特性.间接酶联免疫吸附试验(Enzyme link immunosorbent assay,ELISA)检测结核病人血清中特异性IgG抗体,并与结核杆菌抗体胶体金法诊断试剂盒检测结果对比.[结果]试验表明转化入大肠杆菌中的重组质粒能够表达并纯化出相对分子量为72 kDa的重组蛋白;Western blot证实重组蛋白能够与小鼠抗BCG血清发生特异性反应;重组蛋白免疫小鼠后,小鼠血清中的抗体滴度可达1∶1280以上;重组蛋白用作ELISA包被抗原检测病人血清阳性率为17.3%(30/173),其中排菌病人的阳性率为32.5%(13/42),不排菌病人的阳性率为12.9%.该方法结果与结核杆菌抗体胶体金法诊断试剂盒的检测结果相比,敏感性为51.0%,特异性为96.7%.[结论]结核杆菌PEPCK具有较好的免疫原性和抗原性,有可能作为结核病血清学诊断的一组抗原之一.