汉防己甲素对人鼻咽癌细胞株的放射增敏作用及其机制

 目的：探讨汉防己甲素（Tet）对人鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2的放射增敏作用及其机制。方法：MTT法检测细胞增殖抑制作用,克隆形成实验比较细胞放射敏感性,流式细胞术检测细胞周期分布。结果：Tet对CNE1和CNE2细胞的最大非细胞毒性剂量分别为1.5 μmol/L和1.8 μmol/L,该浓度的Tet联合放射线照射与单纯放射线照射相比,在培养至第4~6 d能明显抑制细胞增殖（P<0.01）。CNE1和CNE2细胞单纯放射线照射组平均致死剂量（Do）分别为(1.26±0.02) Gy和(2.27±0.04) Gy,Tet联合放射线照射组Do分别为(0.73±0.05) Gy和(1.61±0.08) Gy,放射增敏比分别为1.73和1.40（P<0.05）。单纯放射线照射组CNE1和CNE2细胞周期分布以G₂期为主,分别为(42.62±2.07)%和(34.82±2.74)%,Tet联合放射线照射组CNE1和CNE2 G₂期比例分别为(17.02±1.87)%和(19.64±4.82)%（P<0.01）。结论：Tet能增加人鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2对放射线照射的敏感性,机制可能与去除放射线照射诱导的G₂期阻滞有关。     

端粒酶RNA反义核酸降低鼻咽癌细胞p53蛋白表达水平

目的:研究端粒酶活性抑制后鼻咽癌细胞p53蛋白表达水平的变化。方法:脂质体介导端粒酶反义寡核苷酸转染鼻咽癌CNE1和CNE2Z细胞株,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫组化法检测端粒酶逆转录酶(hTRT)和p53蛋白表达水平。结果:端粒酶RNA反义寡核苷酸可抑制CNE1和CNE2Z细胞的增殖并呈剂量依赖性,流式细胞仪检测出现凋亡峰,反义寡核苷酸组hTRT和p53蛋白表达水平显著低于其它处理组及空白对照组(P＜0.01)。结论:端粒酶RNA反义寡核苷酸抑制鼻咽癌细胞端粒酶活性后可降低p53蛋白表达水平。     

阿司匹林对同源不同辐射抗拒能力鼻咽癌细胞的凋亡诱导作用

目的:探讨阿司匹林诱导同源不同辐射抗拒能力鼻咽癌细胞株CNE2R/CNE2凋亡的作用及其机制。方法:采用MTT法、流式细胞术和Western blot法检测并比较阿司匹林对CNE2R和CNE2细胞活力、细胞凋亡及凋亡相关蛋白procaspase-3、cleaved caspase-3、procaspase-9、procaspase-12、PARP、cleaved PARP、Bcl-2和Bax,以及PI3K p110α、Akt和p27蛋白水平的影响。结果:阿司匹林抑制同源不同辐射抗拒能力细胞CNE2R/CNE2的活力(阿司匹林对CNE2细胞作用24、48和72 h的IC50分别为6.18、3.92和3.06 mmol/L,对CNE2R细胞作用24、48和72 h的IC50分别为7.05、3.90和2.20 mmol/L,两者差异无统计学显著性)。阿司匹林作用48 h后,CNE2R细胞凋亡率升高,明显高于CNE2细胞(P0.05)。阿司匹林作用48 h后,CNE2和CNE2R细胞中procaspase-3、procaspase-9、procaspase-12和PARP的蛋白水平降低,cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平升高(P0.05);PI3K p110α和Akt蛋白水平下降,Bcl-2水平降低,Bax水平升高,Bcl-2/Bax比值降低,p27水平升高(P0.05)。结论:阿司匹林对同源不同辐射抗拒能力鼻咽癌细胞株CNE2R和CNE2具有同等细胞活力抑制作用;并且可以诱导细胞凋亡,且对抗辐射细胞株CNE2R的凋亡诱导作用更明显。阿司匹林的抗癌作用可能与其影响PI3K/Akt信号通路及其下游蛋白的水平有关。     

肝癌HepG2细胞株胰岛素样生长因子1和表皮生长因子受体基因沉默后放疗增敏及机制

目的:探讨同时沉默胰岛素样生长因子1(IGF1)和表皮生长因子(EGF)二受体基因的抗瘤放疗增敏及机制.方法:分别构建靶向EGFR、IGF1R及两受体的小分子干扰RNA(siRNA-EGFR、siRNA-IGF1R、siRNA-EGFR& IGF1R),构建与任何基因无同源的阴性对照质粒(siRNA-HK),分别转染48照射肝癌HepG2细胞株.成克隆实验测定细胞存活分数,采用单击多靶模型和线性二次函数模型拟合细胞存活曲线,求出放射生物学参数Do、Dq、N和α、β、SF2值.流式细胞仪检测细胞周期和凋亡变化,细胞周期及相关蛋白、细胞凋亡及相关蛋白采用蛋白印迹.结果:同时沉默EGFR和IGF1R组与对照组及单基因干扰组相比抑制了细胞增殖、诱导细胞凋亡,阻滞细胞周期G1/S期的进程,bcl-2和cdk2表达明显下调,而p21和bax表达增加.且同时沉默EGFR和IGF1R组和对照组细胞的耽值分别为0.588、2.070 4Gy; Dq值分别为0.562 5、2.030 7Gy;α值分别为0.515、0.021 6Gy-1;SF2值分别为0.22、0.619.同时沉默EGFR和IGF1R组Do、Dq和SF2值均减小,α值增大.结论:同时沉默EGFR和IGF1R基因具有更有效地干扰肝癌HepG2细胞株增殖、诱导细胞凋亡,其机制可能与bcl-2和cdk2表达下调和p21与bax表达增加有关,结合干扰多个受体分子可能是一种十分有前途的新的肝癌治疗途经.     

XIAP在鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2和5-8F中的表达与研究

目的比较CNE1、CNE2及5-8F鼻咽癌细胞株中X链锁调亡抑制蛋白(XIAP)的表达差异。方法体外培养鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2及5-8F,采用RT-PCR法检测CNE1、CNE2及5-8F细胞株中XIAP基因表达情况。结果 XIAP基因在CNE1低表达,而在CNE2和5-8F高表达。结论 XIAP与NPC的恶性程度和转移潜能有关。     

荧光染色法观察MPPa光动力诱导鼻咽癌细胞凋亡

目的:探讨MPPa光动力作用诱导鼻咽癌细胞凋亡的生物学效应.材料与方法:应用Hoechst33258细胞核荧光染色法观察MPPa光动力作用对鼻咽癌细胞凋亡的影响.结果:MPPa光动力作用实验组出现核凝聚、凋亡小体的人鼻咽癌细胞株CNE2细胞明显多于单纯光照射组、单纯MMPa光敏剂处理组和假照射组,而单纯光照组、单纯MMPa光敏剂处理组和假照射组三对照组中出现核凝聚、凋亡小体的细胞非常少见.结论:进一步证实了MPPa光动力作用能有效诱导人鼻咽癌细胞株CNE2细胞凋亡.     

整合素β1介导鼻咽癌放射抗拒

目的探讨整合素β1在鼻咽癌放射治疗的作用和机制。方法通过分析两个鼻咽癌表达芯片,比较整合素β1在鼻咽癌组织和非鼻咽癌组织中的表达水平差异;通过Real-time PCR,比较整合素β1在31例鼻咽癌组织和10例非鼻咽癌组织中的表达水平差异;通过分析基因表达芯片,比较鼻咽癌放射敏感细胞株CNE2和放射抗拒细胞株CNE2R中,整合素β1的表达水平;应用逆转录病毒感染鼻咽癌放射治疗抗拒细胞株CNE2R,构建两株整合素β1干扰表达细胞株;应用流式细胞分析技术,检测干扰后整合素β1表达水平;应用不同放射剂量X射线照射细胞株,通过克隆形成实验、γ-H2AX染色以及细胞周期实验,检测整合素β1干扰前后,放射抗拒细胞株CNE2R放射敏感性的变化。结果与非鼻咽癌组织相比较,鼻咽癌组织中整合素β1高表达;与鼻咽癌放射敏感细胞株相比较,鼻咽癌放射抗拒细胞中整合素β1高表达;在鼻咽癌放射抗拒细胞株中,干扰整合素β1表达后,可以有效降低放射治疗存活分数,减弱细胞DNA损伤修复。结论整合素β1介导鼻咽癌放射抗拒。     

亚砷酸对CNE1细胞株增殖和端粒酶hTRT的影响

目的　观察亚砷酸对人鼻咽癌CNE1细胞株增殖的抑制作用及端粒酶逆转录酶 (hTRT)的影响。方法　人鼻咽癌细胞株CNE1用不同浓度亚砷酸处理 ,MTT法观察不同浓度亚砷酸作用不同时间后对CNE1细胞生长的影响 ,流式细胞仪检测不同条件作用后CNE1细胞增殖指数和凋亡指数及周期分布改变 ,免疫组化法检测增殖细胞核抗原 (PCNA)及端粒酶hTRT表达情况。结果　亚砷酸抑制人鼻咽癌细胞株CNE1细胞的增殖 ,其作用随着亚砷酸浓度增加和作用时间延长而增加 ;一定浓度亚砷酸作用于CNE1细胞后 ,其S期细胞比例及增殖指数随着时间的延长而逐渐减少 ,但凋亡指数逐渐增多。随着亚砷酸浓度增加 ,PCNA及hTRT阳性细胞平均灰度值逐渐下降 (P <0 0 5 )。结论　亚砷酸可抑制人鼻咽癌细胞株CNE1的生长 ,除了诱导凋亡以外 ,调控DNA合成及细胞增殖的PCNA蛋白合成降低 ,抑制端粒酶的活性可能是亚砷酸的部分抗肿瘤作用机制。     

基于CRISPR/Cas9技术构建SETD2基因敲除鼻咽癌细胞株并分析其增殖特性

目的:基于CRISPR/Cas9技术构建SETD2基因敲除鼻咽癌(NPC)细胞株,并对该细胞株的增殖特性进行分析。方法:采用RT-PCR及Western blot检测永生化鼻咽黏膜细胞系NP-69及不同分化NPC细胞系CNE1、CNE2Z和C666-1中SETD2的表达情况,筛选出SETD2高表达细胞系CNE1。应用CRISPR/Cas9技术敲除CNE1细胞中的SETD2基因,筛选SETD2稳定敲除细胞株。采用CCK-8和平板集落形成实验分析SETD2基因敲除前后CNE1细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞周期的分布,Western blot检测细胞周期相关蛋白的表达。结果:与NP-69细胞相比,随着细胞分化程度的降低,SETD2在CNE1、CNE2Z和C666-1细胞中的表达逐渐下降(P 0. 01)。基于CRISPR/Cas9方法成功地从15个转染了小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)的CNE1细胞单克隆中筛选出2个SETD2稳定敲除的细胞株CNE1-SETD2-KO-#5和#9。CCK-8及平板集落形成实验结果证实,相对于CNE1-WT细胞,CNE1-SETD2-KO-#5和#9细胞的增殖能力增强(P 0. 05);流式细胞术分析表明,CNE1-SETD2-KO-#5和#9细胞G1期减少而G2/M和S期均增加(P 0. 05); Western blot证实,SETD2敲除后增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期素D1(cyclin D1)、cyclin B1、cyclin A2、cyclin E1、细胞周期素依赖性激酶2(CDK2)和CDK4表达增加,p21表达减少(P 0. 05)。结论:基于CRISPR/Ca9技术成功构建SETD2基因敲除NPC细胞株。NPC细胞中SETD2表达与细胞分化程度有关; SETD2表达缺失通过上调cyclin D1、cyclin B1、cyclin A2、cyclin E1、CDK2和CDK4并下调p21表达而促进细胞增殖。     

沉默FOXO1抑制H2O2诱导的大鼠肺泡2型上皮细胞凋亡

目的探讨沉默叉头蛋白O1(FOXO1)基因表达对H_2O_2诱导的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系(RLE-6TN)活力、凋亡的影响及机制。方法随机将RLE-6TN细胞分为对照组、H_2O_2组、si-FOXO1组和NC组。CCK8法及膜联蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡试剂盒分别检测细胞活力和凋亡率;Western blot检测FOXO1、p53、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和磷酸化的p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38)蛋白表达。结果 H_2O_2可明显上调RLE-6TN细胞FOXO1、p53、Bax和p-p38蛋白表达,抑制细胞活力,诱导细胞凋亡(P0.05),而转染FOXO1 siRNA后可明显降低H_2O_2对FOXO1、p53、Bax和p-p38蛋白表达上调、细胞活力抑制及凋亡诱导作用(P0.05)。结论沉默FOXO1基因表达可抑制H_2O_2诱导的RLE-6TN凋亡,其机制可能与下调p38MAPK信号通路有关。     

鼻咽癌中EB病毒编码的潜伏膜蛋白1对β-catenin转录活性及表达的影响

目的 观察鼻咽癌细胞潜伏膜蛋白1(LMP1)表达对β-catenin的转录活性及蛋白表达的影响,探讨LMP1与Wnt/β-catenin信号通路在鼻咽癌发生发展中的作用.方法应用免疫组织化学EnVision法检测75例鼻咽癌组织中LMP1和β-catenin的表达.构建pHA2-LMP1重组质粒,应用细胞免疫荧光、双荧光素酶报告分析、Western blot方法研究LMP1在鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2中对β-catenin转录活性及表达的影响.结果 (1)鼻咽癌组织中β-catenin的异常表达率为50.7%(38/75),LMP1的阳性表达率为50.7%(38/75).鼻咽癌组织中β-catenin异常表达与LMP1表达存在正相关(相关系数为x2=7.048,P=0.008).(2)LMP1表达明显提高鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2中β-catenin的核表达,且β-catenin的核表达在低分化鼻咽癌细胞株CNE2明显高于高分化鼻咽癌细胞株CNE1.(3)LMP1可明显上调CNE1和CNE2中β-catenin的转录活性,且呈时间依赖性.另外,β-catenin的转录活性在低分化鼻咽癌细胞株CNE2高于高分化鼻咽癌细胞株CNE1.(4)LMP1对鼻咽癌细胞株β3-catenin的总蛋白表达水平无明显影响.结论 EB病毒编码的LMP1可能通过β-catenin信号通路参与鼻咽癌的发生发展.     

EB病毒感染对鼻咽癌细胞生长和凋亡的影响

目的:探讨EB病毒(EBV)感染对鼻咽癌细胞系生长和细胞凋亡的影响。方法:用EBV直接感染人鼻咽癌细胞系CNE1;用免疫组化(LSAB)法检测EBV-LMP1和bcl-2蛋白的表达;用MTT法测定鼻咽癌细胞系的生长能力;用流式细胞术和TUNEL法检测癌细胞凋亡。结果:感染EBV的鼻咽癌细胞系(E-CNE1)的EBV-LMP1表达阳性,生长能力较未感染EBV的CNE1明显增强(P＜0.01),2种鼻咽癌细胞系均无凋亡发生,而均仅有2%~3%的细胞表达bcl-2蛋白。结论:EBV感染和LMP1表达可促进鼻咽癌细胞生长,但对鼻咽癌细胞的bcl-2表达和细胞凋亡无影响。     

EB病毒感染对鼻咽癌细胞生长和凋亡的影响

目的:探讨EB病毒(EBV)感染对鼻咽癌细胞系生长和细胞凋亡的影响。方法:用EBV直接感染人鼻咽癌细胞系CNE1;用免疫组化(LSAB)法检测EBV-LMP1和bcl-2蛋白的表达;用MTT法测定鼻咽癌细胞系的生长能力;用流式细胞术和TUNEL法检测癌细胞凋亡。结果:感染EBV的鼻咽癌细胞系(E-CNE1)的EBV-LMP1表达阳性,生长能力较未感染EBV的CNE1明显增强(P<0.01),2种鼻咽癌细胞系均无凋亡发生,而均仅有2%~3%的细胞表达bcl-2蛋白。结论:EBV感染和LMP1表达可促进鼻咽癌细胞生长,但对鼻咽癌细胞的bcl-2表达和细胞凋亡无影响。     

Photodynamic effect of curcumin on NPC/CNE2 cells.

Nasopharyngeal carcinoma (NPC) is highly prevalent in Southern China. Radiotherapy is the primary treatment of NPC, but the rate of tumor recurrence is significant. Photodynamic therapy (PDT) and the use of natural compounds become one of the new approaches in the investigation of NPC treatment. PDT is an alternate method of cancer treatment while curcumin (CUR) is a compound derived from the traditional Chinese medicinal (TCM) herbs. The purpose of the study focuses on the photodynamic effect of CUR on one of the NPC cell lines, NPC/CNE2. Cytotoxicity and photocytotoxicity of CUR were evaluated by 3-(4,5-dimthyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction assay. Uptake kinetics of CUR in NPC/CNE2 was examined by flow cytometry. The mode of cell death induced by CUR was studied by fluorescence microscopy. Summarizing the results, CUR showed dark cytotoxicity as well as photocytotoxic effects on NPC/CNE2 cells. LC50 of CUR in the dark was about 16 microM. The cytotoxicity of CUR was enhanced by the irradiation of visible light and blue filtered light (maximum transmittance at 300 approximately 400 nm) with light doses of 300 kJ/m2 and 60 kJ/m2 respectively. NPC/CNE2 was found to rapidly take up CUR in the first hour of incubation, and the uptake kinetics steadily increased to a plateau level after 20 hr of incubation. Cell shrinkage and membrane bledding appeared under the observation of fluorescence microscopy. Such evidences proved that CUR might induce apoptosis on NPC/CNE2 cells. The preliminary study confirmed that CUR demonstrated dark cytotoxicity and photocytotoxicty to NPC/CNE2. The mode of action is likely to be induced by apoptotic pathway. CUR may be developed as a potential photosensitizer as well as a chemotherapeutic agent in clinical application.     

可视化鼻咽癌细胞模型CNE2-EGFP的建立

目的利用pEGFP-N1质粒转染鼻咽癌细胞株,建立稳定表达绿色荧光蛋白的鼻咽癌细胞株CNE2-EGFP．为整体鼻咽癌可视化研究提供良好的试验材料。方法利用脂质体转染法,将pEGFP—N1质粒转染鼻咽癌细胞株．通过G418抗性筛选、亚克隆扩增获得GFP稳定表达的人鼻咽癌细胞株CNE2-EGFP。结果成功获得多个稳定表达GFP的人鼻咽癌细胞CNE2-EGFP细胞株,比较CNE2和CNE2-EGFP发现,两者生长曲线、细胞周期分布、裸鼠成瘤能力等均无显著性差异。结论建立了非G418依赖、稳定表达GFP且保持母株细胞特性的人鼻咽癌细胞株CNE2-EGFP,为鼻咽癌整体可视化研究打下了坚实的基础。     

肝素增强佛波酯对人鼻咽癌CNE2细胞的作用：上调c-jun、p53、p21的表达（英文）

目的：观察肝素联合佛波酯对人鼻咽癌细胞的增殖与凋亡的影响及其可能的分子机制。方法：用细胞记数法、流式细胞术观察肝素联合佛波酯对人鼻咽癌细胞的增殖及细胞周期的影响；而用TUNEL、琼脂糖凝胶电泳、Western blot等方法观察肝素与佛波酯联合应用对人鼻咽癌细胞凋亡的作用。结果：肝素与佛波酯联合应用后对鼻咽癌细胞的生长抑制及其凋亡具有显著增强的作用，同佛波酯单独应用于诱导细胞凋亡相比,低剂量的肝素与佛波酯联合应用后发现：TUNEL阳性细胞明显增多；G₁期细胞阻滞，S期细胞明显减少，凋亡率增加；DNA“梯形”变化更加明显；c-jun、p53、p21基因表达明显升高，而c-fos在整个用药过程中没有改变。结论：肝素增强佛波酯对人鼻咽癌细胞的抗增殖及促凋亡，这可能与c-jun、p53、p21的表达上凋有关。