恙虫病东方体Sta56抗原的原核表达、纯化及其在间接ELISA中的应用

目的　构建含恙虫病东方体sta5 6基因的重组表达质粒 ,在E .coli中表达Sta5 6重组抗原 ,纯化后用于间接ELISA检测恙虫病。方法　从含有恙虫病东方体Karp株sta5 6基因的重组质粒TOPO sta5 6扩增出截短的sta5 6 ,定向插入pET30a载体 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,用SDS PAGE及Westernblot进行分析 ;采用电洗脱方法纯化重组抗原并应用于间接ELISA检测恙虫病。结果　以截短的sta5 6基因片段构建了重组表达质粒pETOt95 7,重组的Sta5 6抗原可在E .coli中以融合蛋白的形式有效表达 ,SDS PAGE显示了一条相对分子质量 (Mr)为 4 0 .3× 10 3 的蛋白表达带 ,West ernblot证实该融合蛋白能被恙虫病患者阳性血清所识别。电洗脱纯化的重组抗原应用于间接法ELISA检测恙虫病 ,与间接免疫荧光法IFAT比较 ,其敏感性和特异性分别为 91.7%和 76 .5 %。结论　在大肠杆菌中表达的Sta5 6重组抗原具有免疫反应性 ,纯化后可用作免疫诊断试剂。     

新疆部分地区人群及动物感染恙虫病东方体调查

目的调查新疆部分地区人群及动物感染恙虫病东方体（Ot）情况,并对媒介昆虫进行调查。方法采用多种方法捕获可能感染Ot动物取脾,当地牧民静脉取血,从野鼠体表捕获恙螨,用试剂盒提取DNA,应用巢式PCR（nPCR）检测Ot-Sta56基因;接种昆明小白鼠进行Ot病原传代分离。结果共采取人群血液2430份,在6份血液中检测并分离到Ot;捕获动物13种5783个（只）,从5种啮齿动物（小家鼠、灰仓鼠、大砂土鼠、草原兔尾鼠、灰旱獭）、2种鸟类（麻雀、灰腹鹡鸰）的脾中检测并分离到Ot,从绵羊血液中检测到Ot。其他动物体内未检测到Ot。从野鼠体表分离恙螨5种,从博乐纤恙螨体内检测分离到Ot。基因序列分析表明,新疆地区存在恙虫病东方体的基因型以Karp型为主,可能存在Saitama型。结论新疆地区存在人群及动物感染Ot,其基因型以Karp为主,可能存在Saitama型。     

恙虫病东方体Ot56蛋白序列生物信息学分析

目的分析恙虫病东方体Ot56蛋白序列中的变异区和保守区，为恙虫病的蛋白与核酸诊断提供参考。方法从Gen Bank获取目标序列，用Lasergene、MEGA、Vector NTI suite、Athe Port和NCBI Blast等工具进行分析。结果120条Ot56氨基酸序列的相似性为61.4％-100.0％，变异度为0.0～57．1；氨基酸的105-171、179～215、248～285、375～428和447～503区域为高变异区：膜外区200～400具有变异度高、抗原性强的特性。113条Ot56cDNA序列的相似性为41.8％～100.0％，变异度为0.0～116．1；其中303～481、562～667、756～842、1136～1243和1386～1568等5个区域属高变异区，而0～54、97～171、265～303、439～482、1015～1047和1477～1542为6个保守片段。结论恙虫病东方体Ot56蛋白具有5个高变异区，第200～400位氨基酸附近可能是株（型）特异性表位所在区域，其重组蛋白具有潜在的株（型）鉴定价值。根据cDNA6个保守片段设计引物，进行Ot56核酸检测可能在不同株（型）恙虫病东方体检测中具有较高的敏感性。     

适宜标记的HFRS病毒组特异性McAb的建立与应用

本文用陕西省从黑线姬鼠肺分离的HFRS病毒81-14A株,感染BHK细胞,收集感染细胞。经紫外线灭活后,病毒抗原通过粗提,免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合,建立了适宜于标记的HFRS病毒组特异性3-1C_4 McAb。荧光素标记McAb效价为1:5120,标记后一年半效价下降一个滴度,与26株从不同地区分离的HFRS病毒株作直接免疫荧光反应,均产生较     

恙虫病东方体Sxh951株56kD蛋白的表达及其在ELISA中的应用

目的　构建含OrientiatsutsugamushiSxh95 1株 (Ot.Sxh95 1)相对分子质量 (Mr)为 5 6×10 3外膜蛋白基因 (sxh5 6 )的重组质粒pQE30 5 6 ,表达Mr5 6× 10 3蛋白并观察其在ELISA中的应用。方法　IPTG诱导sxh5 6重组质粒 ;观察SDS PAGE和免疫印迹结果 ;经Ni NTA亲和层析纯化后的重组蛋白分别与Ot.Gilliam、Ot.Karp、Ot.Kato感染鼠血清进行ELISA和免疫印迹检测。结果　SDS PAGE和免疫印迹检测显示有一Mr 约为 5 6× 10 3的特异蛋白带 ;ELISA和免疫印迹结果显示该重组蛋白只与Ot.Gilliam感染鼠血清呈阳性反应 ;重组蛋白用作ELISA包被抗原检测小鼠血清抗体IgG ,特异性为 10 0 % ,敏感性 96 .6 7% ;检测人血清抗体IgG的敏感性为 88.0 8% ,特异性 96 .36 %。结论　表达的重组Sxh5 6蛋白具有良好的免疫反应性 ;其作为ELISA包被抗原 ,具有良好的特异性和敏感性。     

水环境分离细菌及临床分离弗劳地柠檬酸杆菌中喹诺酮耐药基因qnr及aac(6')-Ⅰ b-cr的检测

目的 调查水环境分离细菌及临床分离弗劳地柠檬酸杆菌中喹诺酮耐药基因qnr和aac(6')-Ⅰ b-cr的流行情况及qnr基因型分布.方法 从杭州10个不同的水域中分离细菌,从4个城市的多家医院收集弗劳地柠檬酸杆菌临床菌株.琼脂稀释法测定环丙沙星、左氧氟沙星和萘啶酸对细菌的最低抑菌浓度(MIC).PCR方法检测细菌中qnrA、qnrB、qnrS及aac(6')-Ⅰ b-cr基因.对PCR产物进行测序及序列分析,确定各基因型别.结果 从水环境分离到78株革兰阴性杆菌(包括33株肠杆菌科细菌、21株气单胞菌属、10株不动杆菌属、10株假单胞菌属、2株产碱杆菌属和2株邻单胞菌属细菌).10株弗劳地柠檬酸杆菌中有8株qnrB基因阳性;9株大肠埃希菌中qnrS1和aac(6')-Ⅰb-cr基因阳性各1株;1株斑点气单胞菌(Aeromonas punctata)qnrS2阳性.临床分离的103株弗劳地柠檬酸杆菌中,qnr基因检出75株(72.8%),其中qnrA1有3株(2.9%),qnrB有65株(63.1%),qnrS2有1株(1.0%),qnrA1合并qnrB阳性5株(4.8%),qnrS1合并qnrB阳性1株;aa47(6')一Ⅰ b检出33株(32.0%),其中12株(11.6%)存在-cr变异体.qnrB的基因型以qnrB9、qnrB8和qnrB6为主.结论 首次在欧洲以外地区分离到携带qnrS2基因的气单胞菌属细菌.水环境及临床分离的弗劳地柠檬酸杆菌中qnrB基因的携带率非常高,后者同时有较高的aac(6')-Ⅰ b-cr携带率.弗劳地柠檬酸杆菌中qnrB基因的亚型以qnrB9、qnrB8和qnrB6最为常见.     

恙虫病东方体58kDa热休克蛋白与47kDa外膜蛋白的基因嵌合及58-47嵌合基因在大肠杆菌中的表达

采用PCR方法 ,从恙虫病东方体Karp株基因组DNA中扩增 5 8kDa热休克蛋白的基因 ,将该基因分别与原核表达载体pQE30及 4 7kDa外膜蛋白的基因重组质粒 (pQE30 4 7)连接 ,构建pQE30 5 8及pQE30 5 8 4 7重组质粒 ,用重组质粒转化大肠杆菌。SDS PAGE显示 ,pQE30 5 8和pQE30 5 8 4 7转化的大肠杆菌分别产生一 5 8kDa重组蛋白和一 90kDa的双抗原 (5 8- 4 7)融合蛋白。免疫印迹分析显示Karp株免疫血清能特异识别 5 8kDa重组蛋白和 90kDa融合蛋白 ,90kDa融合蛋白既与 4 7kDa重组蛋白也与 5 8kDa重组蛋白的免疫血清特异反应 ,5 8kDa与 4 7kDa重组蛋白也被 90kDa融合蛋白免疫血清所识别。研究结果证明 5 8 4 7融合蛋白具有恙虫病东方体Karp株 4 7kDa外膜蛋白和 5 8kDa热休克蛋白的抗原特性     

北京东灵山地区不同鼠种体外寄生虫群落的研究

1998年 6月至 1999年 5月在北京东灵山地区的 3类生境中全年共采集到鼠类体外寄生虫 48种 ,3 85 9只 ,其中蚤类 16种 ,5 82只 ,蜱类 3种 ,416只 ,革螨 2 2种 ,10 81只 ,恙螨 7种 ,1780只。在森林中 ,鼠类体外寄生虫群落物种丰富度棕背最高 (2 1) ,大仓鼠最低 (2 ) ;多度表现为社鼠最高 (16 4) ,大仓鼠最低 (7)。在灌丛中 ,鼠类体外寄生虫群落物种丰富度黑线姬鼠最高 (2 4) ,大仓鼠最低 (10 ) ;多度表现为社鼠最高 (76 5 ) ,大仓鼠最低 (2 5 2 )。在农田中 ,鼠类体外寄生虫群落物种丰富度黑线姬鼠最高(2 2 ) ,大林姬鼠最低 (6 ) ;多度表现为大仓鼠最高 (6 2 8) ,大林姬鼠最低 (39)。一般来说 ,鼠类体外寄生虫群落物种丰富度 ,革螨和蚤类较高 ,恙螨和蜱类较低 ,多度 ,恙螨和革螨较高 ,蚤类和蜱类较低     

新疆伊犁那拉提草原啮齿动物感染恙虫病东方体调查

为了解新疆伊犁那拉提草原啮齿动物中自然感染恙虫病东方体(Ot)的情况,在那拉提草原捕获鼠和旱獭,分别取其脾组织提取DNA,应用巢式PCR(nPCR)方法检测Ot-Sta56基因;基因分型引物扩增阳性片段,判断该地区存在的Ot基因型,部分阳性标本测序,通过NCBI网站对序列进行BLAST比较分析.结果显示,在该地区共捕获...     

中国HIV-1病毒分离株的生物学特性与疾病进展关系的研究

目的　从HIV AIDS患者应用微量全血法分离中国HIV 1毒株 ,研究HIV 1的生物学特性与HIV AIDS疾病进展相关性。方法　建立微量全血法 ,从HIV AIDS全血标本中分离 17株HIV 1病毒分离株 ;检测这 17株病毒分离株嗜性和复制动力。结果　从 2 6例HIV AIDS病例中分离出HIV 1病毒 ,分离率为 6 5 .4 % (17 2 6 ) ,其中 17例HIV 1感染者的病毒分离率为 5 2 .9% (9 17) ,均为巨噬细胞嗜性 (M嗜性 ,NSI) ;9例AIDS患者的HIV 1病毒分离率为 88.9% (8 9) ,其中 7株为T细胞嗜性 (T嗜性 ,SI) ,1株为巨噬细胞嗜性。通过检测P2 4抗原确定 17株HIV 1病毒分离株的复制动力。在分离到的 17株HIV 1中 ,SI型病毒分离株与AIDS组显著相关 (P <0 .0 5 ) ;AIDS期的病毒分离株的复制动力明显高于HIV感染期 (P <0 .0 5 )。结论　微量全血法可用于病毒分离。 17株分离株的HIV 1复制动力与CD4 + T淋巴细胞计数呈线性负相关 ,与病毒载量呈正相关。     

大肠埃希菌尿液分离株中检出gyrA基因新变异株

目的 调查大肠埃希菌尿液分离株中喹诺酮类耐药相关基因的存在与变化状况.方法 收集宁波市第一医院2008年10月到2009年3月患者尿液标本中分离的大肠埃希菌共28株,采用聚合酶链反应(PCR)及序列分析的方法分析1种染色体介导的喹诺酮类耐药相关基因(gyrA基因)和5种质粒介导的喹诺酮类耐药相关基因[qnrA、qnrB、qnrS、aac(6＇)-Ⅰb、qepA].结果 28株大肠埃希菌检测到1株aac(6＇)-Ⅰb-Cr基因阳性株(经测序比对证实),qnrA、qnrB、qnrS、qepA基因均未检出.gyrA基因83位密码子28株菌都有突变(100.0%),其突变方式为TCG-83→HTG,导致氨基酸从丝氨酸(S)-83→亮氨酸(L);87位密码子22株菌(78.6%)有突变,可分为两种突变方式:21株(75.0%)突变方式为GAC-87→AAC,导致氨基酸从天冬氨酸(D)-87→天冬酰胺(N);5号株gyrA基因(3.6%)为新亚型,其突变方式为GAC-87→TAC,导致氨基酸从天冬氨酸(D)-87→脯氨酸(Y),另6株菌87位密码子无突变.结论 本组大肠埃希菌gyrA基因突变率为100.0%,是喹诺酮类耐药的主要原因.其他耐药相关基因阳性率很低.     

柯萨奇病毒A组天津分离株的分型鉴定及分子特征分析

目的 鉴定天津市手足口病病原体柯萨奇病毒A组2、4、5、6和10型,并分析其VP1区基因及分子流行病学特征.方法 提取45株非EV71非CV-A16肠道病毒分离株核酸,利用RT-PCR法扩增其VP1基因并测序,然后根据VP1区基因核酸序列,进行肠道病毒型别鉴定和同源性分析,构建种系发生树.结果 45株非EV71非CV-A16肠道病毒天津分离株分别为6株柯萨奇病毒A组2型(Coxsackie virus A2,CV-A2),14株CV-A4,3株CV-A5,8株CV-A6和14株CV-A10.柯萨奇病毒各型的株间核酸序列同源性均在80％以上,各型分离株与原型株的同源性均在71.2％ ～ 85.8％之间.天津各型分离株在种系发生树上均聚集于各自相对独立的分支,与国内流行株处在同一分支内,而与国外原型株处于不同的进化分支.结论柯萨奇病毒A组2、4、5、6和10型成为天津市手足口病的流行病原体,各型天津分离株株间核酸序列同源性较高,呈现一定的区域聚集性.     

四川省分离的基因1型乙型脑炎病毒分子特征分析

目的 从四川省巴中市采集的蚊虫标本中分离乙型脑炎(简称乙脑)病毒(JEV),确定其基因型别,并分析相关的基因1型乙脑病毒PrM和E基因区段氨基酸序列特征.方法 对2004年采集蚊虫标本进行病毒分离,对新分离的乙脑病毒进行生物学、血清学及分子生物学鉴定.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增新分离JEV的PrM、E区段核苷酸序列,测序后应用Clustal X软件做碱基配对分析,MEGA4软件完成病毒进化分析,GENEDOC(3.2)软件完成氨基酸位点分析,根据蜱传脑炎病毒可溶性蛋白晶体结构为模板进行乙脑病毒E蛋白三维结构模拟预测分析.结果 共采集4668只蚊虫标本,主要是骚扰阿蚊和库蚊,分离到6株病毒,经鉴定均属于基因1型的乙脑病毒.将四川省分离的6个毒株结合我国新分离的基因1型乙脑病毒与减毒活疫苗株SA14-14-2株的PrM区段和E区段氨基酸比较,发现PrM区段在PrM2、64和65位存在基因1型乙脑病毒独有的氨基酸位点差异,E区段存在14处共同的氨基酸位点差异,其中在E129、222、327和366位点为中国目前分离到的基因1型乙脑病毒所特有的位点特征.结论 从四川省巴中市首次分离到基因1型的乙脑病毒,并发现基因1型乙脑病毒与减毒活疫苗株之间PrM、E基因区段存在氨基酸差异,但现行疫苗株理论上可以保护新分离的基因1型乙脑病毒.     

四川省分离的基因1型乙型脑炎病毒分子特征分析

目的 从四川省巴中市采集的蚊虫标本中分离乙型脑炎(简称乙脑)病毒(JEV),确定其基因型别,并分析相关的基因1型乙脑病毒PrM和E基因区段氨基酸序列特征.方法 对2004年采集蚊虫标本进行病毒分离,对新分离的乙脑病毒进行生物学、血清学及分子生物学鉴定.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增新分离JEV的PrM、E区段核苷酸序列,测序后应用Clustal X软件做碱基配对分析,MEGA4软件完成病毒进化分析,GENEDOC(3.2)软件完成氨基酸位点分析,根据蜱传脑炎病毒可溶性蛋白晶体结构为模板进行乙脑病毒E蛋白三维结构模拟预测分析.结果 共采集4668只蚊虫标本,主要是骚扰阿蚊和库蚊,分离到6株病毒,经鉴定均属于基因1型的乙脑病毒.将四川省分离的6个毒株结合我国新分离的基因1型乙脑病毒与减毒活疫苗株SA14-14-2株的PrM区段和E区段氨基酸比较,发现PrM区段在PrM2、64和65位存在基因1型乙脑病毒独有的氨基酸位点差异,E区段存在14处共同的氨基酸位点差异,其中在E129、222、327和366位点为中国目前分离到的基因1型乙脑病毒所特有的位点特征.结论 从四川省巴中市首次分离到基因1型的乙脑病毒,并发现基因1型乙脑病毒与减毒活疫苗株之间PrM、E基因区段存在氨基酸差异,但现行疫苗株理论上可以保护新分离的基因1型乙脑病毒.     

云南省西部边境新分离蚊媒病毒分子生物学特征分析

目的 分析云南中缅边境地区新分离蚊媒病毒的分子生物学特征,以分析其遗传进化特征.方法 2010年1-12月在云南省德宏州芒市和瑞丽市监测点每月一次用诱蚊器采集蚊虫,用BHK-21和C6/36细胞分离病毒,阳性分离物用RT-PCR法进行鉴定及序列测定和分析.结果 从采获的7属42种69 209只蚊虫中分离到13株流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV),4株盖塔病毒(Getah virus,GETV),1株西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV),7株淡色库蚊浓核病毒(Culex pipiens pallens densovirus,CppDNV).JEV E基因进化分析证实,新分离的13株JEV均属基因Ⅰ型,与云南其它地区和邻近省份流行株亲缘关系较近,且抗原和毒力位点未发生明显改变.4株GETVE2基因与云南其它地区分离株同源性高,亲缘关系近.新分离环状病毒的VP1基因与TIBOV亲缘关系最近,而与云南环状病毒(Yunnan orbivirus)存在明显差异.7株CppDNV的NS1基因与以往云南及其他省区流行株具有较高的同源性和亲缘关系.结论 首次证实该地区存在基因Ⅰ型JEV、GETV、TIBOV和CppDNV流行,这些流行株均具有较为稳定的遗传特征和地域特征.     

首次从金华地区蜱中检测到莱姆病螺旋体

为了解金华的蜱类及蜱类宿主动物中自然感染莱姆病螺旋体的状况,用PCR法检测鼠体寄生蜱类和宿主动物脏器中莱姆病DNA片段。共采集鼠体寄生蜱41只,从寄生于1只黑线姬鼠和2只小林姬鼠(2只)的3只中华硬蜱雌性若蜱中检测到阳性莱姆病感染。后以引物VS461扩增,此3只中华硬蜱均为阳性。后经克隆测序为B.afzelli(VS461同源株)。初步认为金华地区存在莱姆病病原,尚需进一步调查和病原分离加以证实。     

广东省硇州岛恙虫病疫源地的证实

目的我国广东省硇洲岛位于粤西沿海隶属湛江市，为南亚热带气候，恙虫病发病率高，而国内并无该岛屿恙虫病疫源地特征的记载，本研究对该岛屿作为恙虫病疫源地进行全面的调查与研究。方法疫源地流行病学调查，病原分离与基因检测，宏观预防措施的制定。结果该地区为南亚热带岛屿型疫源地，主要宿主是褐家鼠，主要媒介为地里纤恙螨。从宿主与媒介分离到的恙虫病东方体经基因鉴定主要流行株为Karp株同时还存在Kato株。血清流行病学调查表明该岛居民恙虫病抗体20．6％阳性，部队人群阳性率2．86％。本研究确立了我国硇洲岛恙虫病疫源地类型，针对海岛特点制定了一套预防措施，全面落实预防措施后发病大大减少．尤其是确保了部队在野营、驻训期间没有病例。结论我国广东省硇洲岛是恙虫病疫源地，外来人群尤其要做好防护。     

云南省蚊媒病毒分离物的初步鉴定

本研究对前期从云南蚊虫获得的病毒分离物作进一步鉴定,以明确其分类地位。采用甲病毒通用引物进行RT－PCR检测,在5株病毒分离物扩增出目的基因片段。新分离株4株来自三带喙库蚊,1株来自中华按蚊。它们可使白蚊伊蚊细胞（C6／36）、猴肾细胞（Vero）及金黄地鼠肾细胞（BHK－21）发生规律性细胞病变。核苷酸序列分析显示5株病毒与盖塔病毒（ Getah virus, GETV）同源性最高,与GETV中国云南YN0540株、河北株 HB0234、海南株 M1及南韩株、 LEIV MPR 株、鹭山病毒的同源性为96．4％～99．2％,5株病毒之间的同源性为98．4％～100％。系统进化分析结果显示,新分离株与上述GETV处于同一进化分支。以上结果证实5株病毒分离物为盖塔病毒。     

四川省2007-2014年急性弛缓性麻痹病例中埃可病毒6型的基因特征分析

目的 描述四川省急性弛缓性麻痹(acute flaccid paralysis,AFP)病例中埃可病毒6型(echovirus 6,E6)的基因特征.方法 对四川省2007-2014年AFP病例中分离到的11株E6进行全VP1区逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增和核酸序列测定,进行序列比对和构建进化树.结果 从2889份AFP病例的粪便标本中分离出11株E6病毒.经测序鉴定为C2基因亚型10株,C4基因亚型1株.来源病例的临床诊断分别为:肠道病毒感染6例,周围神经炎l例,格林巴利综合征2例,肌炎2例.C4亚型与10株C2亚型VP1区核酸序列同源性为83.9％-85.2％,氨基酸同源性为96.5％-97.2％;10株C2亚型VP1区核酸序列同源性为94.0％-100.0％,氨基酸同源性为98.9％-100％.结论 2007-2014年四川地区AFP病例中分离到的E6为C2和C4基因亚型,其中以C2基因亚型为主.     

云南省贡山地区小型兽类几种细菌性病原体携带现况调查

为掌握云南贡山地区野生小型兽类的种类和主要细菌性病原体的携带情况,于2014—2015年在该地区诱捕野生小型兽类,进行种类鉴定,解剖取肺、脾等组织。采用巢式PCR对无形体Anaplasmataceae、恙虫病东方体Orientia tsutsugamushi、斑点热群立克次体(Spotted fever group rickettsiae,SFGR)以及莱姆病螺旋体Lyme disease spirochete等4类病原体进行检测。结果共捕获小兽759只,涉及14属35种,优势属为姬鼠属(29.1%)和绒鼠属(17.4%)。对其中541份标本进行无形体PCR检测,结果显示:12份新埃立克体(Candidatus Neoehrlichia mikurensis)阳性,来自姬鼠、绒鼠、鼩鼱和白腹鼠;2份沃尔巴克氏体Wolbachia阳性,来源于鼩鼱和灰腹鼠;3份巴尔通体Bartonella阳性,来源于绒鼠和大足鼠。采用56 k Da基因片段引物对恙虫病东方体进行检测,发现4份阳性标本。其中2份与Boryong血清型菌株同源性最高,均为97.0%;1份与Karp血清型同源性最高,为86.0%;另一份与Kato-related血清型同源性最高,为86.0%,系统发生树显示,其与Kato-related位于同一分支。提示这两份标本可能是恙虫病东方体Karp血清型和Kato-related血清型菌株的变异株。