甲基化结合蛋白2对人胰腺癌PANC1细胞增殖和迁移的影响

目的: 探讨甲基化结合蛋白2 (methyl-CpG-binding protein 2, MeCP2)对人胰腺癌PANC1细胞增殖和迁移能力的影响。方法: 采用qRT-PCR和免疫印迹法检测MeCP2在PANC1、PaTu8988、SW1990 3种胰腺癌细胞株中的表达水平;将干扰质粒shMeCP2(实验组)与对照质粒shEGFP(对照组)分别转入PANC1细胞中,CCK-8和克隆形成实验检测细胞增殖能力,Transwell检测细胞迁移能力。结果： MeCP2在3种胰腺癌细胞中差异性表达。与对照组相比,实验组PANC1细胞中MeCP2 mRNA和蛋白表达明显降低(t分别为6.58,8.42,P均<0.05);细胞相对增殖率、细胞克隆形成数及迁移能力明显降低(P均<0.05)。结论： 下调MeCP2表达可降低胰腺癌PANC1细胞的增殖和迁移能力。     

LncRNA ABHD11-AS1在Erastin诱导的胰腺癌细胞铁死亡中的作用及其机制

［摘要］目的： 探讨长链非编码RNA(long non coding RNA,lncRNA)α/β 水解酶结构域蛋白11的反义链1(α/β hydrolase domain containing protein 11 antisense strand 1,ABHD11 AS1)在Erastin诱导的胰腺癌细胞铁死亡中的作用及其潜在机制。方法: 通过GEPIA平台分析ABHD11 AS1在胰腺癌中的表达和患者预后。采用荧光实时定量PCR(qRT PCR)检测人胰腺癌PANC1、MIApaca 2和PaTu8988细胞中ABHD11 AS1表达,CCK8法计算Erastin半数抑制浓度(IC50)。在PANC1细胞中过表达ABHD11 AS1,分别转染pcDNA3.1、pcDNA3.1 ABHD11 AS1质粒;在PaTu8988细胞中干扰ABHD11 AS1表达,分别转染siControl、siRNA1、siRNA2,qRT PCR检测转染效率,分别予以对照(0 μmol/L Erastin)、Erastin(IC50浓度)处理,CCK8法检测细胞活性,ELISA法检测丙二醛和还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量;另在pcDNA3-1-ABHD11-AS1和siRNA1组加入Erastin的同时加入铁死亡挽救剂Ferrostatin 1,坏死挽救剂Necrostatin-1或凋亡挽救剂Z-VAD-FMK,CCK8法检测细胞活性;免疫印迹法检测5组胰腺癌细胞中谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)以及磷酸化mTOR(p-mTOR)表达水平。结果: 胰腺癌组织中ABHD11-AS1表达水平明显高于癌旁组织,高表达ABHD11-AS1组患者预后较差(P<0.05)。ABHD11-AS1相对表达量由低到高依次是人胰腺癌PANC1、MIApaca 2和PaTu8988细胞,Erasin IC50趋势与ABHD11 AS1表达量相同,依次是2.245、11.760、17.120 μmol/L。与pcDNA3.1组相比,pcDNA3.1 ABHD11 AS1组细胞活性及GSH含量明显增高,而丙二醛含量明显降低(P<0.05);与siControl组相比,siRNA1组和siRNA2组细胞活性及GSH含量明显降低,丙二醛含量明显增高(P均<0.05)。仅Ferrostatin-1可以挽救pcDNA3.1-ABHD11 AS1和siRNA1组细胞活性(P<0.05)。过表达ABHD11 AS1可促进mTOR活化,增强GPX4表达(P<0.05);而干扰ABHD11 AS1则相反。结论: LncRNA ABHD11 AS1可通过活化mTOR促进GPX4表达,从而促进胰腺癌细胞铁死亡抵抗。     

二甲双胍逆转低氧诱导的胰腺癌细胞铁死亡抵抗及潜在的作用机制

目的: 探讨二甲双胍是否能够逆转低氧诱导胰腺癌细胞对铁死亡诱导剂的抵抗,并进一步明确其作用机制。方法: 人胰腺癌Patu8988细胞分别在常氧和低氧下培养不同时间（0、12、24、48 h）,CCK-8法检测细胞增殖,免疫印迹法检测缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor 1α,HIF 1α）蛋白表达;用不同浓度铁死亡诱导剂Erastin分别处理常氧和低氧培养的Patu8988细胞,CCK-8法检测细胞活性;低氧培养的Patu8988细胞分别给予以下处理：对照组、二甲双胍、Erastin、二甲双胍联合Erastin,用CCK 8法检测细胞活性,免疫印迹法检测谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4,GPX4）蛋白表达;用不同浓度二甲双胍处理低氧培养的Patu8988细胞,免疫印迹法分别检测腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）,雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）,HIF-1α等蛋白表达。结果： 与常氧组相比,低氧抑制细胞增殖,且呈时间依赖性,在48 h差异最显著（P<0.05）;Erastin浓度为10 μmol/L时,低氧组细胞活性明显低于常氧组（P<0.05）,为最佳实验浓度;低氧条件下,与单药处理组相比,二甲双胍联合Erastin可以显著抑制细胞活性,降低GPX4蛋白表达水平（P均<0.05）;二甲双胍能够激活AMPK,抑制mTOR磷酸化以及HIF-1α蛋白水平（P均<0.05）。结论： 二甲双胍能够通过AMPK mTOR轴减少HIF 1α表达,从而逆转低氧诱导的胰腺癌细胞铁死亡抵抗。     

HDAC2 siRNA转染对人胰腺癌细胞增殖及凋亡的影响

［摘要］目的: 探讨RNA干扰沉默组蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2,HDAC2)基因表达对人胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法: 培养人胰腺癌PaTu8988细胞株,并将其随机分为5组:空白对照组,20 nmol／L HDAC2 siRNA阴性组,40 nmol／L HDAC2 siRNA阴性组,20 nmol／L HDAC2 siRNA组,40 nmol／L HDAC2 siRNA组。合成针对HDAC2基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),利用阳离子脂质体将HDAC2 siRNA瞬时转染人胰腺癌PaTu8988细胞,分别采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法检测HDAC2基因及蛋白的表达;MTT比色法检测细胞的增殖率;流式细胞术测定细胞凋亡率。结果: 与空白对照组和阴性siRNA 组对比,HDAC2 siRNA组的HDAC2基因和蛋白的表达水平均明显下降(P均<0.05),细胞增殖率减慢(P<0.01),凋亡率明显升高(P<0.01)。结论: 采用RNA干扰沉默人胰腺癌细胞HDAC2基因表达,可抑制癌细胞增殖和诱导其凋亡。     

低氧对胰腺癌PANC-1细胞株中TWIST表达的影响

目的: 探讨低氧条件对胰腺癌PANC-1细胞中TWIST表达的影响及可能的机制。方法：低氧浓度下培养PANC-1细胞,蛋白质印迹检测不同时间点TWIST蛋白的表达水平,免疫荧光检测TWIST、E-钙黏蛋白、 α-平滑肌肌动蛋白（α SMA）和波形蛋白的表达;转染TWIST siRNA后,在常氧及低氧条件下培养,蛋白质印迹检测E-钙黏蛋白, α-SMA和波形蛋白的表达。qRT-PCR及蛋白质印迹检测低氧浓度下PANC-1细胞甲基转移酶样分子3（METTL3）的表达,比色法检测细胞总的N6甲基腺嘌呤（m6A）水平;转染METTL3 siRNA后,在常氧及低氧条件下培养,比色法检测细胞总的m6A水平。在低氧条件下,转染METTL3 siRNA后,qRT-PCR及蛋白质印迹检测TWIST的mRNA和蛋白表达,MeRIP-qPCR检测TWIST mRNA m6A水平;转染METTL3野生型和突变型质粒后,蛋白质印迹检测TWIST蛋白的表达。结果：低氧处理胰腺癌细胞,TWIST表达增加,E-钙黏蛋白的表达下降, α-SMA和波形蛋白的表达升高;而同等低氧条件下敲低TWIST表达后E 钙黏蛋白的表达增加,α-SMA和波形蛋白的表达下降。低氧处理后,胰腺癌细胞中METTL3的mRNA和蛋白表达均显著升高,同时细胞总的m6A水平也显著升高。常氧条件下敲低METTL3表达后胰腺癌细胞总m6A水平轻度下降,而低氧条件下敲低METTL3则显著抑制细胞总m6A水平。低氧条件下敲低胰腺癌细胞METTL3表达对TWIST mRNA表达无显著影响,但其显著降低TWIST mRNA的m6A水平,抑制TWIST蛋白表达;过表达METTL3显著上调TWIST蛋白的表达,而转入METTL3 突变质粒未见相关改变。结论：低氧诱导METTL3表达,后者通过m6A依赖的方式调控TWIST蛋白表达。     

稳定沉默GLI1基因的人胰腺癌细胞株的建立

目的建立稳定转染GLI1siRNA表达质粒的人胰腺癌细胞株,并鉴定其干扰效率。方法采用荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测5株人胰腺癌细胞中GLI1基因的表达,筛选出GLI1基因表达量最高的细胞作为目标转染细胞。脂质体转染法将构建好的3个干扰质粒pGCsi-U6-GLI1siRNA-1、pGCsi-U6-GLI1siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1siRNA-3分别转染入目标细胞,G418抗性筛选阳性克隆,荧光显微镜下观察转染效率。采用qRT-PCR法和蛋白质印迹法检测各组稳定转染细胞中GLI1mRNA及蛋白的表达水平,鉴定干扰效率。结果筛选出GLI1基因表达量最高的Panc-1细胞株作为目标转染细胞;3个干扰质粒均成功转染Panc-1细胞,G418筛选后获得稳定转染细胞Panc-1/GLI1siRNA-1、Panc-1/GLI1siRNA-2、Panc-1/GLI1siRNA-3,荧光显微镜下可见3个质粒的转染效率均在80%以上;qRT-PCR及蛋白质印迹检测证实Panc-1/GLI1siRNA-1、Panc-1/GLI1siRNA-2、Panc-1/GLI1siRNA-3细胞中GLI1mRNA和蛋白的表达水平均显著低于阴性对照质粒(Panc-1/siControl)转染细胞及空白对照细胞(P<0.05),其中Panc-1/GLI1siRNA-1细胞表达量最低。结论成功构建了稳定沉默GLI1基因表达的胰腺癌细胞株Panc-1/GLI1siRNA-1,为后续研究奠定了基础。     

siRNA干扰人宫颈癌基因(HCCR)的表达对胰腺癌PANC1细胞增殖?凋亡和侵袭的影响

目的:建立稳定转染人宫颈癌癌基因(human cervical cancer oncogene,HCCR)siRNA真核表达质粒的人胰腺癌PANC1细胞株,探讨siRNA干扰HCCR的表达后对人胰腺癌PANC1细胞增殖、凋亡和侵袭的影响.方法:通过脂质体转染法将含HCCRsiRNA的真核表达质粒pGCsi-HCCR稳定转染至人胰腺癌细胞株PANC1,抗生素G418筛选获得稳转细胞株;Western blot检测PANC1细胞中HCCR的表达,同时检测肿瘤相关基因p53蛋白表达的变化;流式细胞仪检测PANC1细胞的细胞周期和凋亡率变化;MTT比色法检测siRNA干扰后对PANC1细胞增殖能力的影响:Transwell侵袭实验观察siRNA干扰后对PANC1细胞侵袭能力的影响.结果:Western blot证实siRNA稳转组的PANC1细胞株和空载体稳转组比较HCCR蛋白表达水平下调,稳转细胞株建立成功.siRNA稳转组p53蛋白表达下降.siRNA稳转组的S期细胞数目减少而G0/G1期细胞数目增加,细胞凋亡增加.MTT结果显示siRNA稳转组1和稳转组2细胞吸光度分别为空载体组细胞的0.65倍和0.68倍,细胞增殖能力下降.Transwell侵袭实验显示siRNA稳转组细胞和空载体组细胞穿膜数分别为24.4±9.9和49.1±15.4(P＜0.01),稳转组细胞侵袭能力下降.结论:siRNA干扰HCCR的表达后能抑制胰腺癌PANC1细胞增殖和侵袭,促进其凋亡.     

低氧诱导胰腺癌细胞通过外泌体途径分泌高迁移率族蛋白1

目的: 研究低氧诱导条件下胰腺癌细胞中高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)的分泌途径。方法: 经GEO和TCGA数据库分析HMGB1在胰腺癌样本中的表达;低氧处理胰腺癌PaTu8988细胞0,6,12,24,48 h,免疫印迹法检测培养上清液中HMGB1的含量;采用外泌体提取试剂盒分离常氧和低氧培养液中的外泌体,运用透射电镜观察外泌体膜结构,运用免疫印迹法检测外泌体中的HMGB1以及外泌体标志蛋白CD9、CD63、CD81以及HSP70的表达;利用免疫荧光法和激光扫描共聚焦显微镜观察HMGB1在PaTu8988细胞中的定位情况。结果： 数据库分析结果表明,与健康胰腺组织相比,HMGB1在胰腺癌组织中呈高表达(P<0.01),且高表达者生存期明显短于低表达者(P<0.05)。低氧处理48 h,细胞培养上清液中的HMGB1含量最多,明显高于6,12,24 h。透射电镜观察到培养上清液中有微囊泡结构,直径在100 nm左右,蛋白质免疫印迹法检测到外泌体膜标志蛋白CD9,CD63,CD81,HSP70的表达和外泌体中HMGB1的表达。免疫荧光结果显示,低氧情况下HMGB1和外泌体共定位增多。 结论： 低氧处理条件下,胰腺癌细胞中HMGB1可通过外泌体途径释放到细胞外。     

反义核苷酸抑制人高迁移率族蛋白1表达对胰腺癌细胞的影响

目的　构建高迁移率族蛋白 1(HMGB1)基因的反义真核表达载体 ,寻找胰腺癌基因治疗新途径。方法应用分子克隆技术构建HMGB1基因反义真核表达载体 pcDNA3 1/antisense HMGB1,转染胰腺癌细胞株PANC 1,通过逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、免疫印迹法 (Westernblot)、噻唑蓝 (MTT)比色法检测转染 4 8h后胰腺癌细胞HMGB1基因表达和体外增殖活性的变化。结果　成功构建 pcDNA3 1/antisense HMGB1反义真核表达载体。所获反义表达载体 pcDNA3 1/antisense HMGB1转染可使PANC 1细胞HMGB1mRNA和蛋白表达水平显著降低 (P <0 0 1)。反义 pcDNA3 1/antisense HMGB1的导入能有效抑制PANC 1增殖活性 (P <0 0 1)。 结论　应用反义RNA技术阻断HMGB1基因的表达 ,能有效抑制癌细胞的体外增殖活性 ,为基因治疗提供了新思路     

DPC4基因转染对胰腺癌JF305细胞凋亡的影响

目的:探讨DPC4基因对人胰腺癌JF305细胞凋亡的影响.方法:采用脂质体介导法将pBK-CMV-DPC4质粒导入JF305中,以转染空质粒pBK-CMV和未转染的JF305为对照.采用流式细胞仪法检测3种细胞中Bcl-2和Bax蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖率,流式细胞仪法检测细胞周期,免疫印迹法检测DPC4蛋白的...     

组蛋白HIST1H2AC和HIST1H2BC基因在胰腺癌耐药细胞株中的表达

目的:研究组蛋白HIST1H2AC和HIST1H2BC在培美曲塞诱导的胰腺癌耐药细胞株Puta8988中的基因和蛋白表达水平,以明确HIST1H2AC和HIST1H2BC基因与胰腺癌耐药的关系.方法:以两种剂量的培美曲塞诱导胰腺癌细胞株Puta8988,使其形成两个等级的获得性耐药细胞株Puta8988+、Puta8988++.采用qRT-PCR和Western blotting方法分别检测HIST1H2AC和HIST1H2BC在耐药细胞株及其亲本(对照)中的基因和蛋白表达水平.结果:qRT-PCR检测结果显示,组蛋白HIST1H2AC和HIST1H2BC基因在胰腺癌耐药株Puta8988+和Puta8988++中的表达水平显著上调(P<0.05);Western blotting检测结果显示,组蛋白HIST1H2AC和HIST1H2BC在胰腺癌耐药株Puta8988+和Puta8988++中的蛋白表达水平也显著上调(P<0.05).结论:胰腺癌细胞株经培美曲塞诱导后,其组蛋白HIST1H2AC和HIST1H2BC在基因和蛋白表达水平上均出现上调,提示HIST1H2AC和HIST1H2BC基因可能与耐药有关.     

内质网蛋白驻留受体2蛋白对胰腺癌恶性生长的影响及机制研究

目的:探讨赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸(KDEL)内质网蛋白驻留受体2(endoplasmic reticulum protein retention receptor 2,KDELR2)对胰腺癌细胞恶性生长的影响,并初步探究相关作用分子机制。方法:通过癌症基因组学数据分析平台(UCSC XENA)分析KDELR2 mRNA在泛癌和人胰腺癌组织中的表达水平;通过癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)分析其表达水平与胰腺癌患者临床病理特征及生存预后的关系;采用基因本体功能富集分析(Gene Ontology, GO)、京都基因和基因组数据库富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)探索KDELR2相关差异表达基因参与调节的信号通路;通过ssGSEA算法分析KDELR2免疫浸润情况。应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹实验检测不同胰腺癌细胞系(BXPC-3、MIA PaCa-2、PANC-1、PaTu 8988-T)以及正常人胰腺导管上皮细胞(HPNE)中KDELR2的mR...     

c-Met抑制剂对不同胰腺癌细胞系增殖迁移能力的影响研究

目的 研究c-Met抑制剂SU112748对不同胰腺癌细胞系的增殖和迁移能力的影响.方法 采用WesternBlot技术检测人胰腺癌细胞系PANC、PaCa2、KP-1NL、BxPC-3、KP-3、KP-2、AsPC1及Patu8988中c-Met蛋白的表达量,不同浓度（0.1、1、5及10 μmol/L） c-Met抑制剂SU11274处理c-Met高/低表达细胞各两株,另一组未使用c-Met处理做空白对照.采用MTT法检测细胞增殖、Transwell assay检测细胞迁移能力的改变.结果 c-Met蛋白在BxPC-3、KP-3、KP-2、AsPC1和Patu8988细胞中表达量较高,在PANC、PaCa2和KP-1NL中表达量较低.10μM SU11274作用24h对KP-3细胞株的最大抑制率达（58.3±6.5）％,KP-2细胞株的最大抑制率达（57.2±6.1）％.对KP-2和KP-3细胞的迁移能力有明显抑制作用,分别为对照组的35.7％和41.3％.结论 c-Met抑制剂SU11274能够抑制胰腺癌细胞系的增殖和迁移能力,从而有可能抑制胰腺癌的发生发展.但是应遵循个性化治疗方案,依照照患者c-Met依赖程度进行个性化给药.     

敲减NLRP3抑制LPS诱导BV2小胶质细胞的炎症反应

目的 评价NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)对脂多糖(LPS)诱导的BV2小胶质细胞活化的影响及意义。方法 设计shRNA质粒转染BV2小胶质细胞敲减NLRP3表达,应用qRT-PCR和蛋白质免疫印迹实验挑选转染效率最高序列。运用蛋白免疫印迹法检测细胞系中NLRP3表达情况;光镜下观察NLRP3-shRNA(shNLRP3)转染对细胞系形态学的影响,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培养上清液炎症因子IL-18、IL-1β、TNF-α水平,免疫荧光染色观察小胶质细胞活化标志蛋白iNOS、Arg-1、Iba1表达。结果 NLRP3在LPS诱导的BV2细胞中高表达。NLRP3-mus-727组mRNA表达最低,沉默效果最好,蛋白免疫印迹结果显示细胞转染成功。光镜观察显示转染shNLRP3的BV2细胞系在LPS刺激后呈圆形、短梭形,与空白对照组静息态细胞相似。ELISA检测到转染shNLRP3的BV2细胞系在LPS刺激后促炎性介质IL-18、IL-1β、TNF-α和NO含量较阴性对照组(转染NC shRNA后给予LPS刺激)下降(均P<0.05);免疫荧光染色观察到转染...     

杆状病毒介导的DNA甲基转移酶1 siRNA对人胰腺癌细胞凋亡的影响

目的: 观察杆状病毒介导的DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1, DNMT1) siRNA(小干扰RNA)对人胰腺癌PaTu8988细胞凋亡的影响。方法： 人胰腺癌细胞PaTu8988用6孔板培养并随机分成5组：空白组、阴性组、病毒r-Bac-si-DNMT1-D1组(D1组)、r-Bac-si-DNMT1-D2组(D2组)、r-Bac-si-DNMT1-D3组(D3组)。空白组仅加10%胎牛血清和DMEM培养基培养,阴性组、D1组、D2组、D3组加血清和DMEM培养基培养24 h后,分别加入空白载体r-Bac-CMV-EGFP和重组杆状病毒r-Bac-si-DNMT1-D1、r-Bac-si-DNMT1-D2、r-Bac-si-DNMT1-D3, 150 μL/孔。72 h后收集5组细胞,用流式细胞术测肿瘤细胞凋亡,蛋白质印迹法检测抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表达情况。结果：D1组、D2组和D3组的细胞凋亡率明显高于空白组和阴性组(P<0.05)。与空白组和阴性组相比,D1组、D2组和D3组Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05),Bax蛋白表达显著增加(P<0.05)。结论： 杆状病毒介导的DNMT1 siRNA通过抑制Bcl-2蛋白表达,增加Bax蛋白表达,诱导胰腺癌细胞的凋亡。     

SH-SY5Y神经细胞中α3尼古丁受体基因表达沉默对β分泌酶蛋白表达的影响

目的:研究α3神经型尼古丁受体(nAChR)基因沉默对β分泌酶(BACE)蛋白表达的影响。方法:稳定转染α3 nAChR siRNA表达质粒及空质粒的SH-SY5Y神经细胞与正常对照组细胞,用Real time-PCR和Western印迹法检测α3 nAChR mRNA表达和蛋白水平表达,评价RNA的干扰效率;用蛋白质印迹方法分别检测细胞中β分泌酶2个亚型(BACE1和BACE2)蛋白表达水平的变化。结果:稳定转染α3 nAChR siRNA表达质粒的细胞克隆株,与空质粒和正常对照组相比BACE1蛋白表达水平增加,BACE2蛋白表达水平减少。结论:α3 nAChR可以通过增加BACE2蛋白表达水平及减少BACE1蛋白表达水平,影响Aβ生成从而减少Aβ的神经毒性作用,发挥神经保护作用。     

过表达miR-199-3p/5p诱导胰腺癌细胞BxPC-3、Panc-1铁死亡的作用机制

目的探讨过表达miR-199-3p/5p诱导胰腺癌细胞BxPC-3和Panc-1铁死亡的作用机制。 方法瞬时转染miR-199-3p/5p模拟物和抑制物至BxPC-3、Panc-1细胞中。qRT-PCR检测细胞中miR-199-3p/5p表达水平；Western blotting检测SCL7A11、BTRC、TFRC蛋白水平。谷胱甘肽(GSH)、Fe2＋、脂质过氧化物(LPO)试剂盒检测细胞GSH、Fe2＋、LPO水平。免疫共沉淀检测BTRC、TFRC泛素化水平。双荧光素酶报告实验检测miR-199与靶基因的相互作用。 结果转染miR-199-3p/5p模拟物后,胰腺癌BxPC-3、Panc-1细胞株中miR-199-3p/5p、TFRC蛋白水平显著上调；SLC7A11、BTRC蛋白水平显著降低；LPO、Fe2＋含量升高,GSH含量降低。过表达BTRC能够显著降低TFRC蛋白水平。miR-199-3p靶向结合SLC7A11,miR-199-5p靶向结合BTRC。 结论过表达miR-199-3p/5p诱导胰腺癌细胞BxPC-3和PANC-1铁死亡,可能与靶向抑制BTRC、SLC7A11促进LPO累积有关。     

BTG1过表达对胰腺癌细胞增殖、侵袭和cyclin D1、cyclin B1、MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响

目的探讨B细胞易位基因1(BTG1)过表达对胰腺癌细胞增殖和侵袭的影响及其机制。方法采用qRT-PCR和Western blot检测人胰腺癌细胞株PANC-1、AsPC-1、BxPc-3和正常胰腺导管上皮细胞株H6C7中BTG1 mRNA和蛋白的表达水平。将体外培养的BxPc-3细胞分为对照组(未转染)、pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1空载体质粒)和BTG1组(转染pcDNA3.1-BTG1过表达质粒),转染48 h后,qRT-PCR和Western blot检测转染效果;MTT法、流式细胞术和Transwell小室法分别检测各组细胞的增殖能力、周期分布和侵袭能力;Western blot检测各组细胞中细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、细胞周期蛋白B1(cyclin B1)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白的表达情况。结果与H6C7细胞相比,PANC-1、AsPC-1、BxPc-3细胞中BTG1 mRNA和蛋白的表达水平均明显降低(P0.05),且BxPc-3细胞差异最为显著。与对照组相比,BTG1组细胞的增殖、侵袭能力、细胞在S期的百分比以及细胞中cyclin D1、cyclin B1、MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平均明显降低,而细胞在G0/G1期的百分比明显升高(P0.05);而pcDNA3.1组和对照组细胞的增殖能力、侵袭能力、周期分布情况以及cyclin D1、cyclin B1、MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平均无统计学差异(P0.05)。结论 BTG1过表达可抑制胰腺癌细胞的增殖和侵袭,其作用机制可能与下调cyclin D1、cyclin B1、MMP-2、MMP-9蛋白的表达有关。     

BTG2基因重组慢病毒载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达与功能

目的 构建重组慢病毒载体pCDH-BTG2,并检测其转染肺癌A549细胞后的表达与功能. 方法 通过PCR技术以含B细胞转位基因(BTG2)的cDNA克隆质粒(HsCD00330081)为模板获得BTG2基因片段,将此片段克隆至慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro,形成pCDH-BTG2,转染PC3细胞检测BTG2的表达;将重组慢病毒载体质粒pCDH-BTG2包装成重组慢病毒颗粒,感染肺癌A549细胞后,通过蛋白免疫印迹法检测BTG2的表达,细胞计数法检测BTG2对A549细胞生长的影响. 结果 pCDH-BTG2重组质粒构建成功,转染PC3细胞后可检测BTG2蛋白的表达,pCDH-BTG2包装成慢病毒感染A549细胞后,显著抑制A549细胞的生长. 结论 成功构建了重组慢病毒载体pCDH-BTG2,并发现BTG2抑制A549细胞的生长,为研究BTG2的功能奠定了基础,同时为肺癌的药物研究提供了靶点.     

人胰腺癌细胞株HHIP基因甲基化状态检测和分析

目的:探讨人胰腺癌细胞株HHIP表达与其甲基化的关系,为胰腺癌发生机制的研究提供新的信息。方法:以人胰腺癌细胞株 BxPC-3、CFPAC-1、PANC-1、AsPC-1和PaTu8988s为研究对象,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫细胞化学染色(S-P)法检测去甲基化制剂——DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR) 处理前后各胰腺癌细胞株HHIP mRNA/蛋白表达的变化,用甲基化特异性 PCR(MSP)结合测序检测HHIP基因CpG岛甲基化状态。结果:5-Aza-CdR处理前,胰腺癌细胞株BxPC-3、CFPAC-1、PANC-1、AsPC-1和PaTu8988s无HHIP mRNA/蛋白表达;经5-Aza-CdR处理后,HHIP mRNA/蛋白重新表达。MSP结合测序显示上述胰腺癌细胞株HHIP基因CpG岛存在高甲基化。结论:人胰腺癌细胞株HHIP表达抑制与其基因CpG岛高甲基化相关。HHIP 基因CpG岛高甲基化可能在胰腺癌的发生、发展中起一定作用。