megsin基因转染对高糖环境中肾小球系膜细胞增殖和基质金属蛋白酶2及其抑制因子表达的影响

目的 观察megsin基因转染对高糖环境中肾小球系膜细胞基质金属蛋白酶2（MMP-2）和组织金属蛋白酶抑制因子2（TIMP-2）的表达及Ⅳ型胶原水平的影响,探讨megsin与系膜细胞增殖和细胞外基质代谢的关系。 方法 高糖环境中培养小鼠肾小球系膜细胞,分别于培养12、24、48 h末,应用MTT法检测细胞增殖程度;Western印迹法检测系膜细胞megsin、MMP-2、TIMP-2蛋白表达水平;放免法检测细胞培养上清Ⅳ型胶原浓度。 结果 高糖环境中肾小球系膜细胞megsin、TIMP-2表达上调,MMP-2表达下调,细胞增殖明显,细胞上清液中Ⅳ型胶原浓度升高。megsin基因转染后上述变化趋势更加显著。 结论 megsin可诱导系膜细胞增殖,并通过上调TIMP-2、下调MMP-2抑制细胞外基质降解,是加速肾小球硬化的可能机制之一。     

滋肾通络方对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1、MMP-2、MMP-9mRNA表达影响的实验研究

目的:观察滋肾通络方含药血清对高糖环境下LPS刺激大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)TGF-β1、MMP-2、MMP-9mRNA的影响,并探讨其在防治糖尿病肾病(DN)中的机制。方法:以高糖环境下LPS刺激大鼠肾小球系膜细胞生长建立模型,分为以下8组:(1)正常组;(2)高糖组;(3)高糖+LPS组;(4)苯那普利组;(5)滋肾通络方小剂量组;(6)滋肾通络方中剂量组;(7)滋肾通络方大剂量组。采用RT-PCR技术从分子生物学水平检测各组系膜细胞中TGF-β1、MMP-2及MMP-9mRNA表达。结果:与正常组相比,高糖组、高糖+LPS组TGF-β1mRNA的表达明显升高(P<0.01),MMP-2及MMP-9mRNA的表达明显降低(P<0.01);与模型组相比较,滋肾通络方大、中、小剂量组对大鼠肾小球GMCs TGF-β1mRNA表达显著降低(P<0.05),MMP-2、MMP-9mRNA表达明显升高(P<0.05)。结论:滋肾通络方含药血清能够抑制大鼠肾小球GMCs TGF-β1mRNA的表达,增加MMP-2、MMP-9mRNA的表达,从而通过增加肾小球系膜细胞细胞外基质的降解以延缓DN进展。     

糖肾方对糖尿病肾病大鼠肾组织TGF-β1及MMP-9表达的影响

目的：研究糖肾方对糖尿病肾病大鼠肾组织TGF-β1、MMP-2、MMP-9及Ⅳ型胶原表达的影响,探讨糖肾方对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护机制。方法：50只Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、蒙诺组（0．833mg／kg）、糖肾方大剂量组（2．67g／kg）、糖肾方小剂量组（1．33g／kg）,每组10只,利用单侧肾切除加腹腔注射链脲佐菌素造成糖尿病肾病大鼠模型,连续给药20周。动态检测血糖和尿蛋白／肌酐水平;取肾组织进行病理组织学观察并对肾小球硬化和肾小管间质纤维化程度进行评分;RT-PCR方法检测TGF-β1、MMP-2及MMP-9 mRNA表达,免疫组化方法检测肾组织TGF-β1及Ⅳ型胶原表达。结果：大剂量糖肾方能显著降低糖尿病肾病大鼠尿蛋白／肌酐（P〈0．05）,降低肾小球硬化指数（P〈0．01）和肾小管间质纤维化指数（P〈0．01）,减少TGF-β1mRNA与蛋白表达（P〈0．05）,增加MMP-9mRNA表达（P〈0．05）,减少Ⅳ型胶原蛋白表达（P〈0．05）。结论：糖肾方可减轻实验大鼠肾小球硬化和肾小管间质纤维化,其作用机制可能与抑制TGF-β1表达和提高MMP-9mRNA水平有关。     

高糖通过蛋白激酶C改变肾小球系膜细胞的间隙连接与细胞表型

目的观察高糖环境下，蛋白激酶C（PKC）活性的变化对肾小球系膜细胞间隙连接与细胞表型的影响。方法将体外培养的大鼠肾小球系膜细胞分为低糖组、高糖组、高糖＋PKC抑制剂十字孢碱（SP）组，测定细胞间隙连接蛋白-43（connexin 43）、α-平滑肌肌动蛋白（α—SMA）的表达。结果①与低糖组相比，高糖组细胞PKC活性、mSMA mRNA表达增高，connexin 43 mRNA表达下降，差异有统计学意义（P〈0．05）；②与高糖组相比，高糖＋SP组细胞PKC活性、α—SMA mRNA表达下降，connexin 43 mRNA表达增高，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论高糖通过PKC改变肾小球系膜细胞的间隙连接与细胞表型。     

肾病Ⅰ号方对大鼠系膜细胞增殖及IL-6和FN表达的影响

目的：观察肾病Ⅰ号方（SBYHF）对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞（GMC）的增殖及表达纤维连接蛋白（FN）及白细胞介素-6（IL-6）的影响,探讨其抗肾纤维化的机制。方法：通过体外培养大鼠肾小球系膜细胞技术及体外药物血清实验方法,采用CCK-8法检测GMC的增殖,ELISA法检测FN的分泌水平,RT-PCR法检测IL-6 mRNA的表达。结果：肾病Ⅰ号方可显著抑制GMC和增殖（P〈0.01）,减少FN的分泌和IL-6 mRNA的表达（P〈0.01）。结论：肾病Ⅰ号方可能通过减少GMC和FN的分泌,下调IL-6 mRNA表达,而抑制大鼠肾小球系膜细胞增殖,从而发挥抗肾脏纤维化的作用。     

转化生长因子β1对大鼠原代肾小球系膜细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的：探讨原代培养的大鼠肾小球系膜细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达及转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）对其表达的影响。方法：采用RT-PCR和Westernblot方法检测大鼠原代培养的肾小球系膜细胞VEGF表达及不同浓度、不同时间的TGF-β1刺激对VEGF表达的作用。结果：原代培养的大鼠肾小球系膜细胞表达VEGF164、120mRNA，TGF-β1呈时间依赖性增加其表达，在12h表达最高，分别为刺激前3．17、2．925倍，有统计学差异（P〈0．001）。在剂量反应曲线上，2ng／ml TGF-β1刺激作用最强，VEGF164、120mRNA表达分别为未刺激组的2．82、2．45倍，有统计学差异（P〈0．001）。与VEGF mRNA表达一致，大鼠原代肾小球系膜细胞仅见VEGF164蛋白表达，2ng／ml TGF-β1呈时间依赖性的增加VEGF 164蛋白表达，24h达高峰，为刺激前的2．37倍。结论：促进肾小球系膜细胞VEGF表达可能是TGF-β1介导肾脏损害发生、发展的机制之一。     

高糖对大鼠肾系膜细胞泛素及泛素化蛋白表达的影响

目的 探讨高糖对大鼠肾系膜细胞泛素及泛素化蛋白表达的影响。 方法 将大鼠HBZY-1肾系膜细胞进行体外培养,高糖作为刺激因子,分别设正常对照组(5.6 mmol/L葡萄糖)、高糖组（10、20、30 mmol/L葡萄糖）、甘露醇组。刺激12、24、48 h后,分别用实时定量PCR法和Western印迹法检测各组系膜细胞泛素mRNA和泛素化蛋白的表达。 结果 泛素化蛋白多以大分子蛋白为主。与正常对照组比较,30 mmol/L葡萄糖刺激24 h和48 h后泛素化蛋白的表达分别增加36％和52％（均P ＜ 0.01）;20 mmol/L和30 mmol/L葡萄糖作用48 h泛素化蛋白的表达分别增加31％和52％（均P ＜ 0.01）;高糖作用24、48 h,泛素mRNA的表达显著增加（均P ＜ 0.05）。 结论 高糖呈时间浓度依赖性地促进大鼠肾系膜细胞泛素mRNA及泛素化蛋白的表达,增加泛素蛋白酶体途径活性。     

氟伐他汀对5/6肾切除大鼠肾脏皮质细胞外基质积聚的影响

目的观察降脂药氟伐他汀对5/6肾切除大鼠肾皮质细胞外基质(ECM)积聚的影响和探讨其降脂作用外的肾脏保护机制。方法将5/6肾切除大鼠随机分为模型组和氟伐他汀治疗组(治疗组),另设假手术组作为对照。实验期间测定尿蛋白排泄率;氟伐他汀处理(7mg·kg-1·d-1)13周后免疫组化法检测肾小球Ⅳ型胶原(ColⅣ)及纤连蛋白(FN)蛋白表达;酶谱法检测肾皮质基质金属蛋白酶(MMP)-2活性;免疫印迹检测金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)-2蛋白表达。结果与假手术组相比,模型组大鼠尿蛋白排泄、肾小球Ⅳ型胶原和FN表达均明显增加(均为P<0.01)。模型组大鼠肾皮质MMP-2活性较假手术组明显降低(P<0.01),而TIMP-2蛋白表达明显上调(P<0.01)。氟伐他汀治疗后这些改变均明显好转。结论氟伐他汀可能通过增加5/6肾切除大鼠肾脏MMP-2活性和降低TIMP-2表达,从而能增加细胞外基质降解和减轻肾小球细胞外基质积聚。     

血管内皮生长因子调节小鼠系膜细胞基质金属蛋白酶及其组织抑制物的表达

目的：研究血管内皮生长因子（VEGF）对体外培养的小鼠系膜细胞表达基质金属蛋白酶（MMPs)和金属蛋白酶组织抑制物（TIMPs)的调节作用。方法：对体外培养的小鼠系膜细胞应用人重组VEGF孵育12h，应用蛋白质印迹法检测细胞培养液MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2的蛋白质水平；应用白明胶酶谱法检测MMP2、MMP9的活性；应用RT－PCR检测系膜细胞TIMP1、TIMP2 mRNA表达。结果：VEGF（10ng/ml)可提高小鼠系膜细胞MMP2和MMP9蛋白质释放（和对照组相比分别提高43％和34％，P＜0．05），MMP2和MMP9活性分别提高17％和26％（P＜0．05）。同时，VEGF可呈剂量依赖地下调小鼠系膜细胞TIMP1和TIMP2蛋白质和mRNA的表达，VEGF（25ng/ml)可减少小鼠系膜细胞TIMP1和TIMP2蛋白质释放分别为43％和67％（P＜0．05）；并抑制TIMP1和TIMP2 mRNA的表达（分别下降41％和59％，P＜0．01）。结论：VEGF使系膜细胞MMPs蛋白质表达增加、活性增强，同时下调TIMPs mRNA和蛋白质的表达，可能在增生性肾小球肾炎的发病机制中起一定的作用。     

高糖对系膜细胞胞外调节蛋白激酶表达及细胞外基质合成的影响

目的：探讨高糖环境下系膜细胞中胞外调节蛋白激酶（ERK）转导途径活性和转化生长因子-β1（TGF-β1）mRNA表达的变化。方法：分离培养大鼠肾脏系膜细胞,调整培养液浓度为以下3组,即正常糖组、高糖组、甘露醇组。分别予干预12h、24h、48h后用免疫细胞化学法和Western-blot法对系膜细胞中磷酸化ERK1/2（pERK1/2）的表达进行定位、定性及半定量分析,用RT-PCR法检测细胞中TGF-β1 mRNA的表达,放免法测定各组细胞上清中Ⅳ型胶原的含量。结果：高糖组系膜细胞中pERK1/2蛋白的表达较正常糖组明显增高并由胞浆向胞核内转移,随培养时间延长其表达呈上升趋势（P〈0.01）,高糖组TGF-β1 mRNA的表达及细胞上清液Ⅳ型胶原的含量均高于正常糖组（P〈0.01）,甘露醇组上述指标较正常糖组略有升高,但两组间无统计学意义（P〉0.05）。结论：高糖环境下系膜细胞中ERK信号转导通路被激活,TGF-β1 mRNA表达上调,可能是糖尿病肾病系膜细胞受损,肾小球硬化的机制之一。     

霉酚酸酯对糖尿病肾组织炎性因子表达的抑制作用

目的探讨霉酚酸酯（MMF）在糖尿病肾组织中发挥抗炎作用及其机制。方法MMF治疗2型糖尿病大鼠，观察肾组织单核／巨噬细胞浸润，及转录因子（NF）-KBp65、神经生长因子表达的变化；不同浓度的霉酚酸干预高糖环境下培养的肾小球系膜细胞，测定细胞间粘附分子（ICAM）-1、单核细胞趋化蛋白（MCP）-1及神经生长因子（NGF）表达的变化。结果MMF治疗能显著改善糖尿病大鼠肾功能，伴肾小球NF-KBp65活性明显下降，NGF表达水平明显降低，单核／巨噬细胞浸润显著减轻。霉酚酸对高糖诱导的肾小球系膜细胞ICAM-1、MCP-1和NGF高表达有显著的抑制作用。结论MMF很可能通过降低NF-KB活性，间接抑制炎性因子表达、炎症细胞浸润。霉酚酸对高糖环境下肾小球系膜细胞ICAM-1、MCP-1和NGF的高表达有显著抑制作用。     

缬沙坦对高糖环境下系膜细胞GLUT1表达的影响

目的：探讨葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）在糖尿病肾病发生、发展中的作用以及缬沙坦的肾脏保护机制。方法：体外培养大鼠肾小球系膜细胞,设正常对照组、甘露醇组、高糖非处理组及高糖＋缬沙坦组,Westernblot法检测GLUT1蛋白水平,RT-PCR法检测转化生长因子-β1（TGF-β1）mRNA水平,放免法测定细胞上清中Ⅳ型胶原含量。结果：高糖非处理组GLUT1蛋白、TGF-β1mRNA及细胞上清液Ⅳ型胶原含量均高于正常对照组（P〈0.01,P〈0.05）,缬沙坦干预后上述各指标明显降低（P〈0.01）。结论：高糖刺激使肾小球系膜细胞GLUT1蛋白表达增高;高糖状态下,缬沙坦具有不依赖于其调节肾脏血流动力学改变的肾脏保护作用,该作用可能与其抑制系膜细胞GLUT1过表达,减少TGF-β1与Ⅳ型胶原合成有关。     

愈肾颗粒小复方对大鼠肾小球系膜细胞MMP-3/TIMP-1 mRNA表达的影响

目的：从基因水平探讨愈肾颗粒不同小复方对肾小球系膜细胞基质金属蛋白酶-3（MMP-3）及基质金属蛋白酶抑制物-1（TIMP-1）mRNA表达的影响,对具有延缓和防治肾小球硬化进程的有效药味探讨其作用机制。方法：将愈肾颗粒折方,并重组为益气活血通络（复方1号）、益气解毒活血（复方2号）、益气活血止血（复方3号）不同小复方。应用血清药理学方法,制取3组中药小复方及正常组的药理血清。采用体外培养法培养大鼠肾小球系膜细胞;应用ELISA法测定10%FBS组及血管紧张素Ⅱ组纤维连接蛋白（FN）、Ⅳ型胶原的含量;采用逆转录-聚合酶链反应技术（RT-PCR）观察各组间MMP-3及TIMP-1的mRNA的表达情况。结果：（1）血管紧张素Ⅱ组FN及Ⅳ型胶原的分泌量显著增加,同时与10%FBS组相比差异有统计学意义（P〈0.05）。（2）复方1号组对MMP-3有显著的促进作用,与病理组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。其余各组虽有促进MMP-3分泌的趋势,但差异无统计学意义。（3）3组小复方对TIMP-1的影响差异无统计学意义。结论：（1）复方1号组有显著的促进MMP-3基因表达的作用。（2）复方1号组通过促进MMP-3的基因表达,从而发挥延缓和防治肾小球硬化的作用。（3）复方2号组与复方3号组对MMP-3的基因表达有促进趋势。     

三七总皂苷对大鼠肾小球系膜细胞结缔组织生长因子表达的影响

目的：观察三七总皂苷（total panax notoginseng saponins,tPNS）对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）介导的体外培养SD大鼠肾小球系膜细胞（mesangial cells,MCs）结缔组织生长因子（CTGF）表达的影响,探讨tPNS抗肾小球纤维化可能的分子机制。方法：分离培养SD大鼠MCs,用10-6mol/LAngⅡ刺激MCs,将培养的大鼠MCs分为5组（n=8）：空白对照组、AngⅡ刺激组、AngⅡ和3种不同浓度的tPNS干预组。分别采用RT-PCR、Western Blot、ELISA、RIA法,检测大鼠MCs CTGF mRNA及CTGF蛋白表达及培养细胞上清TGF-β1、FN、LN及Ⅳ型胶原含量。结果：tPNS呈量效依赖性下调AngⅡ介导的大鼠MCsC TGF mRNA及蛋白表达;减少培养细胞上清TGF-β1、FN、LN及Ⅳ型胶原含量。结论：三七总皂苷可通过抑制CTGF mRNA及蛋白的表达,减少细胞外基质沉积,防止肾小球纤维化的产生。     

黄芪、太子参对大鼠肾小球系膜细胞MMP-2及TIMP-2-mRNA表达的影响

目的：观察黄芪、太子参对大鼠肾小球系膜细胞基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）及基质金属蛋白酶抑制剂-2（tissue inhibitor of metalloproteinase-2,TIMP-2）-mRNA表达的影响。探讨黄芪、太子参对肾小球硬化的防治作用。方法：（1）应用血清药理学方法,制取中药的药理血清。（2）采用血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）作为刺激因子,培养大鼠肾小球系膜细胞,使其发生增殖。（3）应用反转录多聚酶链反应技术（RT-PCR）观察各组间MMP-2及TIMP-2m-RNA表达的情况。结果：黄芪、太子参对TIMP-2有显著地抑制作用,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。对MMP-2的影响差异无统计学意义。结论：黄芪、太子参通过抑制TIMP-2的基因表达,从而达到延缓肾小球硬化的作用。     

结缔组织生长因子通过ERK1/2和PI3K信号通路促进大鼠肝星状细胞迁移和基质金属蛋白酶2表达

目的：研究结缔组织生长因子（CTGF）对大鼠肝星状细胞（HSC）迁移及基质金属蛋白酶2（MMP-2）表达及活化的影响。方法分别应用RT-PCR和Western blotting法检测MMP-2表达,明胶酶谱法检测MMP-2的活性;运用Western blotting法检测ERK1/2和Akt的磷酸化水平。运用Transwell小室检测肝星状细胞迁移能力。结果 CTGF呈剂量依赖性促进大鼠HSC中MMP-2 mRNA和蛋白表达;同时CTGF能够促进HSC迁移,MMP-2特异性抑制剂能够抑制CTGF的促迁移作用。ERK1/2和PI3K抑制剂能够显著抑制CTGF诱导的MMP-2表达以及CTGF促进HSC的迁移作用。结论 MMP-2表达和活性的增强在CTGF促进HSC迁移过程中发挥着重要作用,ERK1/2和PI3K信号通路在CTGF促进MMP-2表达发挥关键作用。     

祛毒颗粒对5/6肾切除大鼠肾脏皮质MMP-2、TIMP-2、ECM及足细胞超微结构的影响

目的：观察祛毒颗粒对5/6肾切除大鼠肾皮质基质金属蛋白-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）和金属蛋白酶组织抑制物-2（tissue inhibitor of metalloproteinase-2,TIMP-2）蛋白表达、细胞外基质（extracellular matrix,ECM）积聚和足细胞超微结构的影响。方法：将55只Wistar大鼠随机取10只为正常对照组,余用5/6肾切除法建立慢性肾衰竭（CRF）动物模型,将造模成功后的大鼠随机分为模型组、尿毒清颗粒组（简称对照组）、祛毒颗粒低剂量组（简称低剂量组）、祛毒颗粒高剂量组（简称高剂量组）,每组10只,分别给与相应浓度和剂量的药物,实验期间测定大鼠的尿蛋白、肾功能,治疗12周后观察其肾脏病理改变,PAS染色评价肾小球硬化程度,免疫组化法检测肾小球Ⅳ型胶原（ColⅣ）、纤连蛋白（FN）和MMP-2、TIMP-2蛋白表达,电镜观察足细胞超微结构。结果：祛毒颗粒能明显减少5/6肾切除大鼠尿蛋白量（P〈0.05）,改善肾功能;减轻肾脏病理损害;PAS染色显示,祛毒颗粒治疗后肾小球阳性面积与肾小球总面积比值、肾小球硬化指数明显下降（P〈0.01）;免疫组化检查显示祛毒颗粒能抑制了FN、ColⅣ在肾组织的表达（P〈0.01）,下调TIMP-2蛋白表达,增加MMP-2活性,减轻ECM积聚;电镜观察显示,祛毒颗粒能减少足细胞脱落,减轻足突融合,保护足细胞形态。结论：祛毒颗粒通过调整5/6肾切除大鼠肾皮质MMP-2、TIMP-2的表达,促进ECM降解,减轻ECM集聚,保护足细胞,起到减轻肾小球硬化的作用。     

柴芩肾安方对IgA肾病大鼠肾小球足细胞nephrin表达的影响

目的：探讨柴芩肾安方对IgA肾病（IgAN）大鼠肾小球足细胞nephrin表达的影响。方法：通过切除单侧肾并反复静脉注射葡萄球菌肠毒素B（SEB）复制大鼠IgAN模型,分为正常组、切肾组、IgAN组、柴芩肾安方组和氯沙坦组。第12周末,检测各组大鼠24h尿蛋白量（Upr）,观察肾小球形态学和超微结构变化,并采用免疫组化和实时定量PCR法检测肾小球足细胞nephrin蛋白及mRNA的表达。结果：与正常组相比,IgAN组大鼠Upr显著升高（P〈0.01）,肾小球系膜增生,足突融合明显,足细胞nephrin蛋白及mRNA表达均明显下调（P〈0.01）。经柴芩肾安方治疗后上述指标均明显改善,与IgAN组比较差异有统计学意义（P〈0.01或P〈0.05）。结论：柴芩肾安方能减轻IgAN大鼠蛋白尿及肾小球病变,这可能与其恢复肾小球足细胞nephrin表达有关。     

连黄降浊颗粒对5/6肾切除大鼠肾功能和肾皮质细胞外基质积聚的影响

目的：观察连黄降浊颗粒对5/6肾切除大鼠肾功能和肾皮质细胞外基质（ECM）积聚的影响。方法：将45只Wistar大鼠随机取8只为正常对照组,余用5/6肾切除法建立慢性肾衰竭（CRF）动物模型,将造模成功后的大鼠随机分为模型组、尿毒清颗粒组（对照组）、连黄降浊颗粒低剂量组（低剂量组）、连黄降浊颗粒高剂量组（高剂量组）,分别给予相应浓度和剂量的药物。实验期间测定大鼠的肾功能、尿蛋白,治疗12周后观察其肾脏病理改变,免疫组化法检测肾小球Ⅳ型胶原（ColⅣ）、纤连蛋白（FN）和肾皮质基质金属蛋白（MMP-2）和金属蛋白酶组织抑制物（TI MP-2）蛋白表达。结果：连黄降浊颗粒能明显改善CRF大鼠肾功能、减少尿蛋白的排出（P〈0.05～0.01）,减轻肾脏病理损害;连黄降浊颗粒能下调TI MP-2蛋白表达,增加MMP-2活性,抑制了FN、ColⅣ在肾组织的表达（P〈0.01）,减轻ECM积聚。结论：连黄降浊颗粒可明显改善肾功能,增加肾脏MMP-2活性,降低TI MP-2表达,增加ECM降解,减轻肾小球硬化。