口蹄疫A型病毒AF/72株特异性鉴定及其豚鼠标准血清的制备

用口蹄疫A型病毒AF/72株的细胞毒AF/72/MF6/BF12,经测定其TCID50为108.0/ml;经RT-PCR获得其VP1基因序列,并与GenBank中的其他7株口蹄疫A型病毒株比对,同源性均大于85%;经间接夹心ELISA测定,OD值均大于0.2,且该毒仅能被口蹄疫A型标准血清中和,具有型特异性;经紫外分光光度法测定其146S含量,均值为189 ng/ml,远大于22 ng/ml的国际标准.将此细胞毒与弗氏佐剂联合制成灭活疫苗免疫豚鼠后分离血清,经无菌检验和外源病毒检验,纯净性达到兽用生物制品标准要求;经ELISA检测此血清的抗体滴度、原血清、强阳性血清和弱阳性血清的中和效价均远小于1 ∶ 45.参照标准的要求,确定强阳性血清为口蹄疫A型病毒株AF/72的参考血清.     

口蹄疫A型病毒AF/72株免疫原性分析

用口蹄疫A型病毒AF/72株,经RT-PCR获得其VP1基因序列,并与GenBank中的其他5株A型口蹄疫病毒株比对,同源性均大于90%。将此病毒灭活后与弗氏佐剂联合制成灭活疫苗免疫豚鼠后分离血清,经液相阻断ELISA和微量细胞中和试验检测此血清的抗体效价,其均值分别为2.093和1.227。用微量细胞中和试验分别测定了AF/72参考血清对5株A型口蹄疫病毒的中和抗体效价,各试验重复3次,其平均值为2.156。分别计算AF/72对5株不同病毒株的r值,结果为0.79~0.92,均值为0.85。按照OIE标准,AF/72具有较强的免疫原性,抗原谱广,可作为制造口蹄疫A型疫苗的备选毒株。     

口蹄疫A型病毒AF/72株标准乳鼠组织毒的研制

用口蹄疫A型病毒AF/72株的第3代乳鼠组织毒,通过乳鼠适应至6代,获得该毒株的乳鼠组织毒AF/72/MF6,经测定其LD50为10^-8.0·mL^-1;经RT-PCR获得其VP1基因序列,并与GenBank中的其它6株口蹄疫A型病毒株比对,同源性大于85%;经无菌检验和外源病毒检验,纯净性达到兽用生物制品标准要求;经间接夹心ELISA测定,OD值均大于0.2,且经乳鼠中和试验证实该毒仅能被口蹄疫A型标准血清中和,具有型特异性;经紫外分光光度法测定其146S含量,均值为189 ng·mL^-1,远大于22 ng·mL^-1的国际标准。综合纯净性检验、特异性检验和146S含量测定结果,可确定AF/72/MF6为口蹄疫A型病毒AF/72株乳鼠组织毒的标准毒。     

口蹄疫病毒O、A、Asia I型定型诊断胶体金免疫层析方法的建立

[目的]建立一种从田问样品中快速、灵敏、简便检测O、A、Asia I型口蹄疫病毒抗原的胶体金免疫层析方法(GICA).[方法]采用柠檬酸三钠还原制备胶体金颗粒,标记纯化的标准株O、A、Asia I型口蹄疫抗体.将纯化的口蹄疫流行株O/China99,A/AF72 and Asia I/China05抗体和羊抗豚鼠抗体分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带.经试验条件优化,组装形成胶体金定型诊断试剂盒.[结果]本试验研制的口蹄疫定型试剂盒具有良好的灵敏度,可检测到7.8×104 LD50(1:128倍稀释乳鼠毒)的病毒量.同时对阳性及阴性样品进行3次重复检测结果完全相同,说明其有较好的重复性;特异性试验证实该方法在检测口蹄疫临床症状相似病原,如猪水疱病抗原(SVD)、水泡性12炎(VS)、水泡性疹(VES)等病毒时无交叉反应;试剂盒对206份已知血清型田间及实验室样品的符合率试验,O、A、Asia I型和阴性样本的符合率分别为92.45%、91.66%、92.75%、100%定型准确率94.58%.试剂盒在4℃下可保存6个月.[结论]本试验研发的12蹄疫病毒胶体金定型诊断试剂盒是一种快速、灵敏、特异的FMD抗原检测方法,对基层现场具有广泛应用价值.     

农村散养猪口蹄疫免疫方法研究

[目的]为了制定在农村散养条件下猪口蹄疫控制的疫苗免疫策略。[方法]研究猪口蹄疫O型和亚洲I型母源抗体、口蹄疫免疫后抗体消长规律和猪瘟与口蹄疫免疫干扰。[结果]结果表明,仔猪口蹄疫O型母源抗体能保护15日龄内仔猪,而亚I抗体不能保护仔猪。2 ml免疫剂量组的O型和亚I抗体水平均明显高于1ml免疫剂量组,1次免疫接种不能形成免疫反应的抗体平台期,抗体效价迅速下降;2次免疫接种后60 d达到峰值,O型和I型抗体滴度维持长达60 d以上;猪瘟和口蹄疫疫苗同时免疫相互不发生干扰。[结论]结合农村散养实际情况,为提高免疫保护力,建议实行30日龄同时首免口蹄疫和猪瘟,间隔28 d进行二免,每次免疫剂量口蹄疫为2 ml/头,猪瘟为2头份/头。     

口蹄疫病毒O型Cathay毒株的分离鉴定

[目的]研究FMD疑似组织病料,为口蹄疫相关研究工作提供试验参考。[方法]应用细胞培养、电镜观察、反向间接血凝试验、RT-PCR及测序技术对FMD疑似组织病料进行分离鉴定,确定其血清型及基因型。[结果]结果显示,分离鉴定的FMD疑似组织病料为O型Cathay口蹄疫病毒株。[结论]为口蹄疫的诊断、防治、流行病学调查及疫苗的研究使用奠定了基础。     

口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型定型诊断胶体金免疫层析方法的建立

【目的】建立一种从田间样品中快速、灵敏、简便检测O、A、Asia I型口蹄疫病毒抗原的胶体金免疫层析方法（GICA）。【方法】采用柠檬酸三钠还原制备胶体金颗粒,标记纯化的标准株O、A、Asia I型口蹄疫抗体。将纯化的口蹄疫流行株O/China99,A/AF72 and AsiaⅠ/China05抗体和羊抗豚鼠抗体分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带。经试验条件优化,组装形成胶体金定型诊断试剂盒。【结果】本试验研制的口蹄疫定型试剂盒具有良好的灵敏度,可检测到7.8×104 LD50（1﹕128倍稀释乳鼠毒）的病毒量。同时对阳性及阴性样品进行3次重复检测结果完全相同,说明其有较好的重复性;特异性试验证实该方法在检测口蹄疫临床症状相似病原,如猪水疱病抗原（SVD）、水泡性口炎（VS）、水泡性疹（VES）等病毒时无交叉反应;试剂盒对206份已知血清型田间及实验室样品的符合率试验,O、A、AsiaⅠ型和阴性样本的符合率分别为92.45 %、91.66%、92.75%、100%定型准确率94.58%。试剂盒在4℃下可保存6个月。【结论】本试验研发的口蹄疫病毒胶体金定型诊断试剂盒是一种快速、灵敏、特异的FMD抗原检测方法,对基层现场具有广泛应用价值。     

猪O型口蹄疫母源抗体消长规律及疫苗免疫的干扰作用

[目的]制定科学合理的免疫程序,从根本上控制仔猪O型口蹄疫的发生。[方法]采用ELISA抗体检测试剂盒对涪陵某规模化养殖场母猪和仔猪进行了母源抗体和免疫抗体检测。[结果]仔猪在10日龄左右抗体效价最高,平均效价为2.62。随着日龄的增长,仔猪母源抗体水平迅速下降至不完全保护水平。不同日龄首免仔猪口蹄疫疫苗免疫抗体检测结果表明母源抗体效价对试验猪的免疫应答有较大的影响。[结论]30～45日龄是仔猪接种FMD疫苗的最佳时间,这与母源抗体的消长规律相一致。     

鸡传染性贫血病胶体金快速诊断试纸条的研制——鸡传染性贫血血清抗体的制备、纯化及检测

[目的]为建立鸡传染性贫血病(CIA)诊断方法奠定基础。[方法]对15周龄SPF鸡进行4次免疫后,制备鸡传染性贫血病血清抗体并对其进行纯化,测定抗原最佳包被浓度和血清的最佳稀释度,研究纯化后血清抗体的蛋白含量和效价。[结果]阳性血清和阴性血清的最佳稀释度为1∶100,病毒包被抗原最佳包被浓度为5μg/ml。血清抗体蛋白含量为13.2 mg/ml,血清抗体效价为1∶12 800。[结论]该研究为制备CIA胶体金快速诊断试纸条奠定了基础。     

液相阻断ELISA检测方法在猪牛A型口蹄疫免疫抗体检测中的应用

用液相阻断ELISA试验方法监测辖区内经口蹄疫A型灭活疫苗免疫牛血清样品593份,其中:规模场牛群免疫抗体滴度<1∶64的有24份,抗体滴度≥1∶64的有82份,抗体保护率为77.79%;散养户牛群免疫抗体滴度<1∶64的有54份,抗体滴度≥1∶64的有433份,抗体保护率为88.91%。在猪群推广免疫口蹄疫A型灭活疫苗并跟踪监测血清样品20份,检测结果与北京市兽医兽医诊断所检测结果相同,抗体滴度≥1∶64的有20份,抗体保护率为100.00%,为推广口蹄疫A型灭活疫苗在猪群免疫提供了试验数据。     

棘胸蛙虹彩病毒免疫方法研究

[目的]研究棘胸蛙虹彩病毒疫苗体表喷雾和肌肉注射的免疫效果,为其免疫方法提供理论依据。[方法]用不同浓度棘胸蛙虹彩病毒灭活疫苗进行体表喷雾免疫和肌肉注射免疫,并进行血清抗体效价检测和相对免疫保护率测定。[结果]注射0.2 m L 1×108TCID50/m L疫苗组21 d血清中和抗体效价最高达到380.2,相对免疫保护率达到80%;体表喷雾1×107TCID50/m L疫苗组,28 d最高抗体效价为320.0,相对免疫保护率为60%。[结论]肌肉注射疫苗和体表喷雾疫苗对棘胸蛙都有较好的免疫效果,肌肉注射疫苗组的免疫效果最佳,但喷雾免疫可作为棘胸蛙快速无损伤免疫的一种有效途径。     

嵌合型口蹄疫病毒样颗粒组装研究

[目的]为研究和制备多联或多价口蹄疫病毒样颗粒疫苗奠定基础.[方法]将FLAG序列通过融合PCR技术插入口蹄疫结构蛋白VP1GH-loop可变区,并通过大肠杆菌原核表达技术表达口蹄疫病毒衣壳蛋白VP0、VP3和嵌合型VP1,在体外组装出嵌合FLAG外源多肽的口蹄疫病毒样颗粒.[结果]大肠杆菌表达的口蹄疫衣壳蛋白主要以可溶性存在,在缓冲体系中融合标签被切除衣壳蛋白VP0、VP3和FLAGVP1组装成病毒样颗粒,其大小约25 nm左右.FLAG序列成功插入GH-loop可变区第150-151氨基酸位点之间,外源多肽的插入没有影响衣壳蛋白VP1的空间结构.[结论]口蹄疫loop可变区引入外源抗原是可行的,但外源多肽的大小及理化性质会影响病毒样颗粒的组装效率.     

仔猪O型口蹄疫母源抗体消长试验

[目的]为制定科学合理的仔猪口蹄疫免疫程序提供依据。[方法]以规模化养猪场和散养户中经猪口蹄疫O型灭活疫苗免疫后母猪所生产的仔猪为研究对象,利用液相阻断ELISA诊断试剂盒对仔猪母源抗体消长情况进行检测。[结果]仔猪通过母乳获得被动保护,在21日龄母源抗体达到高峰,规模化猪场和散养户母猪的平均效价分别达1∶142和1∶89。规模化猪场场仔猪21~30日龄保护率在80%以上,45日龄下降到65%,60日龄时基本无保护;而农户仔猪21日龄保护率为60%左右,30日龄仅为40%左右。农户饲养母猪免疫抗体水平远低于规模化猪场。[结论]对规模化猪场的仔猪进行口蹄疫疫苗的最佳首免时间为45~50日龄,而对散养户仔猪的最佳首免时间应为30日龄左右。     

干扰素对新城疫灭活苗抗体滴度的影响

[目的]探讨干扰素对新城疫(ND)灭活苗抗体滴度的影响。[方法]将20只20日龄雏鸡随机分成A、B、C和D(CK)组,每组5只。分别皮下注射新城疫灭活疫苗0.5 ml/羽,同时给雏鸡注射高(4单位)、中(2单位)和低(1单位)剂量的干扰素,对照组不加,检测雏鸡新城疫病毒抗体滴度。[结果]结果表明,免疫7d后,高、中和低剂量组抗体水平一致,并开始上升,3组剂量组之间无明显差异;14 d后中剂量组水平稍高,与其他3组均差异显著,呈现一定的剂量差异;21 d后3组都升高,但中剂量组抗体水平最高,对照组与其他3组均有显著差异;在免疫28 d后4个组的抗体水平均下降,但中剂量组抗体水平仍最高。[结论]干扰素可提高新城疫抗体滴度,以中剂量添加效果最好。     

鸡传染性法氏囊病高免血清的制备与检验

[目的]探索一种新的制备鸡传染性法氏囊病高免血清的方法。[方法]采用IBDV灭活苗对27日龄SPF鸡作基础免疫,活疫苗作3次加强免疫,四免后21 d采血制备高免血清。[结果]试验结果表明随着免疫次数的增加,试验鸡IBD中和抗体滴度逐步增加,一免和二免后中和抗体分别为12 log2和13 log2,三免和四免后中和抗体达到最高值15 log2。[结论]采用该方法免疫SPF鸡,有效保护了法氏囊不受损伤,3次免疫即可获得高效价的IBDV抗血清。     

基于免疫层析试纸的猪O型FMDV抗体水平监测

为了应用免疫层析试纸评价猪口蹄疫O型合成肽疫苗的免疫效果,对50头试验仔猪进行免疫注射,并在首次免疫后28 d及2次免疫后20 d采血,通过试纸定量测定结果来监测试验猪抗体水平变化,同时对比猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒的检测结果.结果表明,猪口蹄疫O型合成肽疫苗能快速诱导产生高水平的抗体,首次免疫抗体阳性率达88%,2次免疫抗体阳性率高达100%.试纸定量测定结果表明,2次免疫后猪群免疫抗体水平整体显著提升,并保持在较高水平.与ELISA试剂盒比较二者具有相同的敏感性和特异性,符合率为100%.     

汉中地区鸡禽流感母源抗体与免疫抗体的监测及免疫程序的建立

[目的]为禽流感免疫程序的建立提供依据。[方法]从汉中市某规模化养鸡场采集罗曼蛋鸡的血清样品,检测不同时期的抗体水平。接种禽流感油乳剂灭活苗后,检测用不同剂量的疫苗免疫后雏鸡血清中抗体水平。[结果]1d雏鸡平均母源抗体效价为8.9,在19d降到4.3。免疫36d后,平均抗体效价达6.37,保护率为100%。免疫85d后,抗体达最高值。免疫9周后,平均抗体水平降至4.17,保护期约为2个月。禽流感的首免时间应在出生后19～22d。首次免疫85d后,HI抗体水平逐渐降至临界值。建议在3月龄左右进行第2次免疫,剂量可增大到0.5ml/只。[结论]鸡场应建立抗体效价监测手段,应对抗体水平偏低或空白的鸡群及时再接种。     

免疫程序对肉鸡新城疫·禽流感(H5亚型)HI抗体消长规律的影响

[目的]为制定商品肉鸡新城疫(ND)、禽流感(AI)的免疫程序提供理论依据。[方法]在调查不同规模化养殖场免疫程序的基础上,制定商品肉鸡的免疫程序,分析不同免疫程序下ND和AI(H5亚型)HI抗体消长规律。[结果]1~7日龄商品肉鸡ND和AI的母源抗体均维持在免疫保护临界值之上。用ND疫苗免疫后,鸡群抗体水平不断下降,各免疫组均在24日龄最低。使用ND活疫苗和灭活苗的免疫组中ND抗体滴度比其他免疫组高。非免疫组AI(H5亚型)抗体滴度均随日龄的增加而逐渐下降,而免疫组24日龄后缓慢上升,38日龄达到免疫保护临界值。[结论]禽流感(H5亚型)灭活苗对商品肉鸡的免疫效果较差,应从免疫佐剂、抗原浓缩等方面进行新型商品肉鸡禽流感疫苗研究。     

胰蛋白酶浓度对H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上增殖的影响

[目的]探讨不同胰蛋白酶浓度对低致病力禽流感病毒在MDCK细胞上增殖后的HA滴度。[方法]通过3株禽流感H9亚型病毒分别接种MDCK细胞单层,加入含有不同胰蛋白酶浓度的DMEM维持液,每隔24 h观察细胞病变,并测定上清液中的HA滴度。[结果]当维持液中胰蛋白酶含量为10～20μg/ml时,培养液上清液中的HA滴度最高,达到7 log2（1∶128）。当病毒的接种浓度为10-3和10-4时,MDCK细胞在96 h几乎全部病变,峰值出现在接种后的72～96 h。[结论]当维持液中胰蛋白酶含量为10～20μg/ml时,有利于H9亚型AIV病毒在MDCK细胞上增殖。