SV40(Simain Virus40)的分子生物学研究进展

SV4 0 (Simain Virus4 0 )是猿猴的病毒 ,但与多种人类肿瘤关系密切 ,因此引起人们的重视。 SV4 0基因组较小 ,广泛的用于载体构建和细胞转化的研究。对于 SV4 0的分子生物学特性及其与人类肿瘤的关系还在进一步研究中 ,本文就此综述了国内外相关的研究进展     

人脑肿瘤组织中SV40感染及其临床意义

目的 探讨猴病毒40（SV40）与人脑肿瘤发病的关系。方法 采用聚 一等奖反应（PCR）和原杂交（ISH）同时检测30例正常人脑组织和198例人及脑肿瘤组织以及SHG44和BT3 25两株人脑胶质瘤细胞系中SV40 DNA充列;并对SV40 DNA阳性肿瘤细胞采用免疫共沉淀和Western blot检测大T抗原（Tag）的表达及Tag-RB复合物的存在。结果 人脑肿瘤组织PCR SV40 DNA阳性率为48.5％（96／198）,其中胶质瘤47.2％（42／89）,脑膜瘤48.8％（21／43）,脑垂体腺瘤51. 4%(18/35),神经鞘瘤43.8％（7／16）,先天性肿瘤53.3％（8／15）,正常人脑组织PCR SV40 DNA阳性率为6.7％（2／30）。SHG44及BT325两株细胞中也分别检测出SV40的DNA序列。人脑肿瘤组织SV40 DNA阳性率显著高于正常人脑组织（P＜0.01）。经ISH,仅在96例PCR SV40 DNA阳性的及脑肿瘤组织中检出87例阳性,2例SV40 DNA阳性的正常人脑组织中1例ISH阳性,SHG44及BT325两株细胞ISH SV40 DNA均阳性。SV40 DNA定位于肿瘤细胞核,阳性细胞呈弥温或片灶状分布。96人列SV40 DNA阳性脑瘤组织Tag表达阳性75例,所有Tag表达阳性瘤组织均发现Tag与RB形成特异性复合物。结论 人脑肿瘤组织中存在SV40感染,提示SV40感染与有脑肿瘤有关;在人脑肿瘤组织中Tag广泛表达,Tag可能是SV40在有禽肿瘤发生发展中起作用的重要因素,S V40 Tag与RB形成特异性复合物Tag-RB,导致RB活性,有是SV40致人脑肿瘤发生的一个重要机理。     

恶性间皮瘤可能与致瘤性猿猴病毒SV40无关

目的探讨致瘤性猿猴病毒SV40（simian virus 40）是否与中国人恶性间皮瘤的发生相关。方法从蜡块中提取17例恶性间皮瘤组织中的DNA后,用三组引物对SV40大T抗原（TAg）的基因片段分别进行聚合酶链反应（PCR）扩增,另外,用两种SV40相关抗体（Pab101和Ab-2）分别进行免疫组织化学染色,检测肿瘤组织中是否存在SV40 TAg。结果（1）一组引物的PCR反应仅有3例扩增出了SV40TAg的基因片段,其余两组引物的PCR反应均为阴性。（2）两种抗体的免疫组织化学染色均未检测出SV40TAg。结论中国人恶性间皮瘤与SV40感染的关系可能不密切。     

SV40和多瘤病毒的转化基因

SV40和多瘤病毒能在体外转化哺乳动物细胞,使呈肿瘤细胞特性,研究表明它们基因组内的“早期”区城能有效地诱导转化,利用免疫沉淀方法已鉴定出其蛋白质产物—“肿瘤”抗原(T-抗原),SV40中有二种:分子虽为100,000的大型T(T)和     

SV40T促进施旺细胞重编程为间充质干细胞

目的鉴于施旺细胞(SCs)在外周神经损伤修复中发挥关键作用,本研究旨在通过猿猴病毒40大T抗原(SV40T)建立永生化的小鼠坐骨神经施旺细胞系及探讨其分化潜能。方法通过MPH 86质粒转染小鼠坐骨神经SCs,然后使用潮霉素筛选细胞并传代培养,将转染SV40T的SCs指定为SV40T-SCs。利用WST-1检测细胞增殖,并通过qPCR分析细胞SV40T及神经标志物的表达情况。将SV40T-SCs进行免疫组织化学染色。最后,在体外诱导SV40T-SCs进一步分化。结果 SV40T-SCs的细胞形态多样,增殖迅速,可以永续传代,与原代SCs显著不同。SV40T-SCs高表达Nestin、Pax3和Slug。免疫组织化学染色显示CD44、CD73和CD105阳性。另外,SV40T-SCs在体外可被诱导分化为骨细胞和脂肪细胞。结论 SV40T可能诱导小鼠坐骨神经SCs发生重编程作用,使SCs转化成为间充质干细胞(MSCs)。     

猴空泡病毒40核酸序列检测法的优化研究

目的 对通常使用的猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40,SV40)核酸序列检测法进行优化,寻找敏感性高、特异性强、适用面广的SV40核酸序列检测引物.方法 以21个SV40毒株完全基因组为基础数据,用Primer Premier 5.00软件重新设计两对SV40 DNA检测引物,用Oligo 6.71软件和DNAMAN 6.0.40软件对引物参数进行分析,将分析结果与通常使用的检测引物进行比较.用不同稀释度SV40核酸序列作模板,比较4对引物检测的敏感性.分别用无菌水、Vero细胞DNA、SV40 DNA作模板检测4对引物的特异性.结果 对于21个SV40病毒株,优化引物对VP1和T的序列是保守的;对于接受号为J02400、NC_001669、AF316139和AF316141的4个病毒株,通常使用的引物对GCVP1和GCT的序列是保守的;用同一稀释度的SV40 DNA作模板,引物对VP1和T的扩增效率明显高于引物对GCVP1和GCT;在特异性检测比较中,引物对VP1和T没有出现非特异性扩增条带,引物对GCVP1和GCT在100 bp处出现非特异性扩增条带.结论 优化的SV40核酸序列检测法具有敏感性高、特异性强、检测面广、引物及其PCR产物序列保守等特点.     

猴病毒40(SV40)与人类癌的发生可能无关

长期以来，人们一直认为猴病毒40(SV40)可以引发某些癌症。但据Nature杂志报道，由纽约Memorial SloanKettering癌症中心病理医生Ladanyi等领导的研究小组的一项新的研究发现，SV40引起癌症可能是实验室污染的结果。这项研究可能解决了一个长期悬而未决的问题，那就是20世纪50～60年代污染了脊髓灰质炎疫苗的SV40是否感染了被免疫的病人和引起了胸部、骨、脑和血液系统癌症。     

SV40增强子修饰提高人端粒酶逆转录酶启动子的转录活性

人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因启动子能启动治疗基因的表达,用于治疗端粒酶阳性肿瘤。已有研究运用hTERT启动子携带肿瘤治疗基因进行肿瘤靶向性的基因治疗。天然hTERT启动子的活性表达相对较弱,我们通过构建hTERT—SV40这一嵌合启动子系统来增强hTERT启动子的靶向转录活性,以期为建立活性更高的肿瘤特异性启动子系统奠定基础。     

SV40T胃壁细胞定位表达转基因小鼠的建立

目的 构建胃壁细胞定位表达SV40T的真核表达载体并制备转基因小鼠动物模型,为研究胃癌发病机制提供动物模型.方法 从构建的胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV中酶切回收3.8kb的基因片段H -K ATPase β promoter/SV40T,通过显微注射的方法制备转基因小鼠,PCR和Southern blotting检测阳性转基因小鼠并建系繁殖,RT-PCR检测基因的表达情况.结果 将422枚注射过的受精卵移植给16只假孕雌鼠,共生出77只仔鼠,移植成功率为18.2%.在出生的77只仔鼠中,2#、4#、8#、16#、24#、51#、57#、61#、68#、73#经PCR检测为阳性首建鼠.除68#不育外,其他9个品系首建鼠共生出99只F1代鼠.8#品系23只F1代尚未发现阳性鼠,另8个品系F1代经PCR和Southern blotting检测发现31只阳性鼠,阳性率为40.8%(31/76).RT-PCR检测F1代阳性鼠均仅在胃组织中有SV40T基因的表达,而在心、肝、肾、肺、食道、肠、骨骼肌等组织中均不表达.不育首建鼠处死解剖发现胃组织有肿瘤存在.结论 建立了胃壁细胞定位表达SV40T基因的转基因小鼠动物模型.     

032 CD40-CD40L与疾病

T淋巴细胞与抗原提呈细胞之间的信号传递调控着免疫系统的发展,其中CD40与其配体CD40L(CD154)的相互作用,不仅对T细胞活化和效应功能的表现起重要作用,且在抗感染、抗病毒及抗肿瘤和动脉粥样硬化症中扮演重要角色.本文综述了CD40-CD40L与人类疾病关系的研究进展.     

SV40介导人多药耐药基因-1转导人造血细胞

将基因转入细胞常用逆病毒和AAV及脂质体作为载体,但这些载体对处于非分裂状态细胞如人骨髓是无效的。SV40因其高传导效率和广泛的宿主范围,近几年来成为人们注目的载体,它能将基因有效地转入人体各种细胞包括骨髓细胞。SV40为环状双DNA,属乳多空病毒,大小为5.2kb。最初在美国作为脊髓灰质炎疫苗污染物成分被发现,但随机检查发现对人类并不致病。本文证实了SV40转导3.8kb MDR基因的可行性,并发现了经体外包装后的SV40假病毒粒子—pSM1。 选用COS做包装细胞,其他细胞有CMT4,K562,NIH-3T3,P388,MEL。用RT-PCR,罗丹明-123拒染法和流式细胞分析法检测细胞基因的转录     

SV40TAg真核表达载体的设计与构建

目的 设计并构建SV40TAg真核表达载体。方法 采用重叠延伸拼接法从pUC19-SV40载体中克隆切除了内含子的SV40LT基因全长，在其5’端连上loxP位点，EcoR I、BamH I双酶切，同时采用重叠延伸拼接法从pEGFP-N1真核表达载体中克隆EGFP基因全长，并在3’端连上loxP位点，两个酶切产物连接后定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体，DNA序列分析鉴定重组质粒。结果 SV40LT基因和两个loxP位点成功克隆至pEGFP-N1真核表达载体中。结论 本实验构建的SV40LT重组质粒为利用SV40T抗原进行黑素细胞发育、分化，黑素生成以及黑素瘤发生等研究提供了新的分子工具。     

活化T细胞核因子对组成性启动子SV40的调控作用

目的:利用双荧光素酶报告系统探讨活化T细胞核因子(NFAT)能否调控常见组成性启动子CMV,SV40和TK,为不同条件下选择合适双荧光报告系统内参提供依据。方法:用限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ分别从质粒pCDNA3.1和pRL-TK中切下CMV和TK启动子,克隆至pGL3-basic载体中,构建成pCMV-Luc和pTK-Luc载体。将构建pCMV-Luc和pTK-Luc以及商品化的pGL3-control(SV40启动子驱动),分别与SV40(pBIND)和TK(pRL-TK)两种启动子驱动的两种内参质粒共转染入HEK293细胞;观察过表达组成性活化NFAT后相对荧光素酶活性读数的改变。结果:成功构建了pCMV-Luc和pTK-Luc质粒,荧光素酶活性检测发现,常见组成性启动子SV40启动子对过表达组成性活化的NFAT存在一定的反应。结论:T细胞活化过程中重要的转录因子NFAT能够调控SV40启动子活性;表明常见组成性启动子SV40并非真正、绝对的组成性不变。因此,在荧光素酶报告系统内参选择时需要充分考虑该问题,本研究为合理选择内参质粒提供了一个可行策略。     

SV40-转化的成人早老综合征成纤维细胞系自发突变率升高

成人早老综合征(WS)是一种罕见的常染色体隐性遗传性疾病,以种种的早衰表现为特征.WS患者的皮肤成纤维细胞在体外寿命缩短,生长缓慢和DNA复制速度减慢,但在DNA修复方面无异常.本文研究目的是了解WS细胞自然突变率是否增高.因原代WS细胞增殖能力有限,难于用来分析其自然突变率.故用WS细胞系的SV40转化的细胞株PSV811和W-V,并以SV40转化的正常细胞株W138VA13和AG80B作对照.     

CD40—CD40L与疾病

T淋巴细胞与抗原提呈细胞之间的信号传递调控着免疫系统的发展,其中CD40与其配体CD40L（CD154）的相互作用,不仅对T细胞活化和效应功能的表现起重要作用,且在抗感染,抗病毒及抗肿瘤和动脉粥样硬化症中扮演重要角色,本文综述了CD40－CD40L与人类疾病关系的研究进展。     

携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体的构建与结构鉴定

目的构建携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体,优化目前的肝细胞永生化。方法去除eGFP终止子taa的pSEB-HUS质粒为逆转录病毒基础质粒。先将SV40T及其启动子hEFH亚克隆至pSEB-HUS,再将LoxP位点插入至pSEB-SV40T质粒的抗性基因Blasticidin上游获得pSEB-LoxP-SV40T质粒。同时将CD自杀基因定向克隆至pSEB-HUS的eGFP下游;然后设计一段HSV-tk自杀基因引物,在上游引物的5′端加入方向一致的LoxP序列。PCR获得TK基因后,定向克隆至CD下游获得pSEB-CD-TK,最后将pSEB-CD-TK上的双自杀基因亚克隆至pSEB-LoxP-SV40T质粒上得到携带双自杀基因及SV40T的质粒。结果PCR及酶切鉴定均证实两个自杀基因及SV40T正确克隆至逆转录病毒质粒中,目的基因序列与GenBank报道一致,两个LoxP位点方向相同。结论成功构建携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体。     

SV40大T抗原在人脑肿瘤中与p53形成特异性复合物

目的 探讨SV40早期区域基因编码产物大T抗原（Tag) 表达及与抑癌蛋白p53的相互作用在人脑肿瘤发生发展中的意义。方法 采用免疫共沉淀及Western印迹法检测43例人脑肿瘤组织及5例正常人脑组织中Tag的表达，并对18例Tag阳性瘤组织检测Tag-p53复合物的存在。结果 Tag在5例室管膜瘤及2例脉络丛乳头状瘤中全部表达，垂体腺瘤（5／6）、星形胶质细胞瘤（7／10）、脑膜瘤（4／6）、多形性胶质母细胞瘤（3／5）及髓母细胞瘤（2／5）均有Tag的表达，3例少枝胶质细胞瘤、1例松果体瘤及5例正常人脑组织无Tag表达；检测18例Tag阳性瘤组织均发现Tag与p53形成特异性复合物。结论 在人脑肿瘤组织中Tag广泛表达，Tag可与p53形成特异性复合物，Tag-p53特异性复合物的形成导致p53失活，可能是SV40致人脑肿瘤发生的一个重要机理。     

体外转染SV40的鼠内皮细胞生长特性的研究

体外培养的内皮细胞具有血清和生长因子的依赖性，且具有异质性，用其进行体外研究血管生成结果难以分析。本实验拟用SV40转染鼠内皮细胞，为体外研究血管生成提供稳定内皮细胞株。     

免疫共刺激分子CD40在肿瘤临床治疗中的应用

共刺激分子CD40/TNFRSF5隶属肿瘤坏死因子受体超家族,在机体固有免疫应答及适应性免疫应答中均发挥关键作用.CD40生理性表达于专职性抗原提呈细胞、内皮细胞等细胞表面,是T细胞表面CD40L分子的天然糖蛋白受体.CD40-CD40L信号通路的激活参与T淋巴细胞活化、抗体类别转换、抗原提呈细胞激活等一系列免疫相关生物学过程.除免疫细胞等生理性表达外,CD40在血源性及上皮源性恶性肿瘤细胞表面亦存在表达,并通过直接影响肿瘤细胞或间接干预肿瘤微环境参与肿瘤的发生、发展.大量研究表明,CD40激动型抗体可能通过激活宿主抗肿瘤免疫应答或直接促进CD40肿瘤细胞凋亡等途径正向干预实体肿瘤进展,提示CD40可能作为有效的肿瘤免疫治疗靶点.现对CD40分子在肿瘤发生、发展中的生物学作用及CD40-CD40L通路在肿瘤免疫治疗中的应用进展及存在问题予以综述.     

人类抗人CD40单克隆抗体免疫激活活性依赖于其Fc与FcγRⅡB相互作用

激动型抗CD40单抗能够激活APC表面CD40免疫共刺激信号,促进其成熟和交叉提呈抗原并激活抗原特异性CTL以杀伤肿瘤,多年来一直是肿瘤免疫治疗的研究热点。以鼠源抗体为基础的研究表明,激动型抗鼠CD40单抗的活性受到抑制性Fcγ受体(FcγRⅡB)的驱动,但尚不清楚这一调控机制是否影响人类抗人CD40(hCD40) IgG单抗。为此,作者研究了Fcγ受体(Fcγreceptor, FcγR)结合能力对人类抗hCD40单抗活性的影响,发现抗体恒定区(Fc)失去FcγR结合能力会严重削弱人类激动型抗hCD40 IgG1单抗活性;同时,FcγRⅡB特异性阻断抗体可以显著抑制人类激动型抗hCD40 IgG1单抗活性;此外,增强抗体Fc的FcγRⅡB结合能力能够提高抗体的激动活性。而且,多个抗原结合表位不同的人类抗hCD40单抗在实验中表现一致,说明抗CD40单抗的激动活性普遍依赖于FcγRⅡB。上述研究有助于探索激动型抗CD40单抗的活性调控规律,为设计更好的激动型抗hCD40抗体提供思路。