胰酶联合Ⅱ型胶原酶法体外分离培养软骨细胞的分析

目的 通过原代软骨细胞的体外培养和鉴定,探讨胰酶联合Ⅱ型胶原酶法体外分离培养软骨细胞的可行性.方法 分离出兔鼻中隔软骨组织,用胰酶联合Ⅱ型胶原酶的方法进行消化,获取原代软骨细胞.使用倒置显微镜观察软骨细胞的形态及生长情况,并用甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化及免疫荧光染色进行表型鉴定.结果 软骨细胞原代培养形成单层细胞需要7～8d,传代培养时间约2～3 d,细胞以圆形或类上皮细胞形态为主,甲苯胺蓝染色证实细胞可特异性合成糖胺聚糖,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色及免疫荧光染色可证实细胞可特异性分泌Ⅱ型胶原.结论 本研究成功建立了简单易行的胰酶联合Ⅱ型胶原酶法体外分离培养大量纯净的软骨细胞,提高了消化速率,加大了细胞释放率,为组织工程气管软骨种子细胞的获取提供重要的技术支撑.     

细胞与组织工程血管支架的黏附方法选择

目的 选择观察细胞和组织工程血管支架黏附的最佳方法.方法 用生物可降解材料聚β羟基丁酯(PHB)作为支架材料,运用盐析方法制成实心和不同孔径的膜片;将培养的第3代血管平滑肌细胞种植于膜片上,于培养的第1、3、7、11、14天,采用倒置显微镜下观察、苏木素-伊红(HE)染色、甲苯胺蓝染色、扫描电镜检查及MTT法检测材料上细胞附着和生长情况.结果 倒置显微镜下无法观察附着于材料上的细胞;HE和扫描电镜标本制备过程中细胞丢失多,不能为材料提供准确的信息;甲苯胺蓝染色可快速观察材料上细胞附着情况;MTT法可定量测定材料上的细胞数.经比较发现,150～200μm孔径的PHB膜片上血管平滑肌细胞附着和生长最佳.结论 甲苯胺蓝染色和MTT比色法是观察细胞在材料上黏附和生长的最佳方法.     

兔颞下颌关节骨关节病中基质金属蛋白酶组织抑制剂-1表达的研究

目的了解基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)在创伤性骨关节病髁状突中的表达,探讨其在发病中的作用。方法新西兰大白兔24只随机分为4组,一组为正常对照组,另3组建立创伤模型。切取TMJ行HE、甲苯胺蓝染色。组织学评分采用改良的Mankin′s方法。采用SABC法检测TIMP-1在不同观察时限髁状突原位表达情况。结果 TIMP-1细胞分数在正常对照组、1周组和4周组、8周组软骨中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论 TIMP-1在创伤性骨关节病的病理过程中是否发挥增生修复作用,还需要进一步的实验证实。     

兔颞下颌关节骨关节病中基质金属蛋白酶组织抑制剂-1表达的研究

目的 了解基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)在创伤性骨关节病髁状突中的表达,探讨其在发病中的作用.方法 新西兰大白兔24只随机分为4组,一组为正常对照组,另3组建立创伤模型.切取TMJ行HE、甲苯胺蓝染色.组织学评分采用改良的Mankin′s方法.采用SABC法检测TIMP-1在不同观察时限髁状突原位表达情况.结果 TIMP-1细胞分数在正常对照组、1周组和4周组、8周组软骨中的表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 TIMP-1在创伤性骨关节病的病理过程中是否发挥增生修复作用,还需要进一步的实验证实.     

兔膝关节软骨单位体外酶解法消化 分离的实验研究

目的探讨兔膝关节软骨单位(Chondron)体外酶解法消化、分离的可行性及实验方法。方法 2月龄新西兰白兔8只,随机分为2组,各4只。无菌条件下剖取双膝关节全层软骨,一组采用常规0.4%Pronase酶和0.025%Ⅱ型胶原酶依次消化为软骨细胞;另一组采用0.3%dispase酶和0.2%Ⅱ型胶原酶联合搅拌消化3h为软骨单位。利用倒置显微镜观察、细胞爬片苏木素-伊红(HE)和Ⅵ型胶原免疫荧光染色以及微系统测试分析仪进行软骨细胞及单位形态学分析,Annexin-Ⅴ/PI流式细胞术检测软骨细胞及单位早期凋亡率。结果倒置显微镜下软骨单位主要由1或几个串珠状细胞形态构成,透亮程度较差;而软骨细胞均表现为单一透亮的圆形细胞形态。软骨细胞HE染色呈爬片形态,胞质膨松透亮;软骨单位细胞周围存在一层淡染基质成分,且Ⅵ型胶原免疫荧光染色强阳性表达,界限清晰,可见大量由其包裹1、2、3或4个软骨细胞的单位形态。微系统分析仪下软骨单位由高到低均分为细胞核、细胞质及PCM三层结构,每一层梯度高度约0.4μm。急性消化软骨细胞和单位在活细胞率、早期及晚期凋亡率方面差异无统计学意义。结论 0.3%dispase酶和0.2%Ⅱ型胶原酶联合搅拌消化3h可以成功获取兔膝关节软骨单位,为其体外进一步研究奠定基础。     

新型丝素蛋白支架复合兔髓核细胞体内初步构建组织工程髓核的研究

目的探讨新型丝素蛋白多孔支架复合经PKH26标记的兔髓核细胞初步构建组织工程髓核的可行性。方法消化分离兔髓核细胞,培养获取P1代细胞,对P1代髓核细胞行番红O以及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色;PKH26标记兔髓核细胞,MTT法检测标记前后髓核细胞增殖情况,将标记后的细胞接种支架,体外培养4 d后,将细胞-支架复合物植入裸鼠皮下,体内培养12周后,进行活体荧光成像技术检测、HE染色、甲苯胺蓝染色、番红O染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色。结果 P1代髓核细胞番红O染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性;标记后细胞荧光强度分布均匀,标记前后髓核细胞光密度(OD)值比较差异无统计学意义(P>0.05);活体成像技术显示裸鼠皮下植入的细胞-支架复合体呈现强烈荧光;HE染色见多孔支架内壁有大量髓核细胞填满并分泌大量细胞外基质;甲苯胺蓝染色、番红O染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色均呈阳性,细胞周围大量细胞外基质分泌。结论以新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞经体内培养形成的类髓核样组织,可用于组织工程化髓核的构建。     

咬合创伤兔颞下颌关节的组织学变化的实验研究

目的:探讨咬合创伤对兔下颌髁突软骨的影响.方法:实验组于一侧下颌第一前磨牙备洞,粘接桩钉造成与对颌牙的急性牙合创伤,于各时间段取髁状实,常规包埋切片,进行HE染色,镜下观察组织形态变化.结果:实验组髁突软骨出现退行性改变,髁突软骨层次排列紊乱,细胞数减少,纤维层、增殖层、肥大层变薄.结论:咬合创伤可导致髁状突软骨发生退行性病变,其变化程度与创伤因素作用时间、强度有关.     

DNA倍体分析在口腔癌及癌前病变中的应用

目的评价和比较脱落细胞DNA倍体分析与甲苯胺蓝染色两种方法对诊断癌前病变和口腔癌的应用价值。方法收集山西省人民医院口腔外科门诊及住院患者220例,分组应用DNA倍体分析和甲苯胺蓝染色两种检查方法检测。结果 DNA倍体分析对癌前病变和恶性病灶都显示出高特异性和灵敏度;而甲苯胺蓝对癌前病变和恶性病灶染色结果显示出中等灵敏度和低特异性。结论对于口腔癌及癌前病变的诊断,脱落细胞DNA倍体分析在灵敏度和特异度方面都优于甲苯胺蓝染色。     

体外培养时间对兔间充质干细胞软骨形成的影响

目的　探讨生长因子(bFGF,TGF -β1)诱导下,培养时间对兔间充质干细胞(MSCs)体外软骨形成的影响。方法　取兔 MSCs 梯度离心,分离培养。取 P3、P5、P7、P10 代细胞,在 bFGF、TGF- β1 各20 ng/ml诱导下培养。观察细胞生长形态变化,用甲苯胺蓝染色观察细胞蛋白多糖的分泌。RT- PCR半定量检测Ⅱ型胶原mRNA的相对表达量,取关节软骨细胞作阳性对照。结果　各代细胞形态无明显差异。MSCs甲苯胺蓝染色呈异染性,RT- PCR检测Ⅱ型胶原阳性表达,各代细胞灰度值,P3 0 .16±0 .05,P5 0 .37±0. 03,P7 0 .88±0 .08,P10 0. 47±0. 05,软骨细胞 2 08±0 13。P7代细胞灰度值达最大(P<0 .01),软骨细胞是 MSCs的 3 倍以上。结论　生长因子能维持 MSCs细胞活性,促进生长繁殖。一定培养时间内,软骨生成能力渐增强,但随时间进一步延长,软骨分化减弱。     

马钱子碱对体外培养的人软骨细胞增殖的影响

目的观察中药马钱子的提取物马钱子碱(strychnine)对体外培养的人软骨细胞增殖的影响。方法提取、分离人软骨细胞,用甲苯胺蓝染色确定软骨细胞的存在,将第2代软骨细胞以5×104个细胞的密度分别接种于高、中、低剂量组、对照组及硝普钠组,48h后用MTT比色法检测软骨细胞增殖。结果马钱子碱高、低剂量组软骨细胞的增殖率均低于对照组(P<0.05),中剂量组的增殖率高于对照组(P<0.05),并且中、低剂量组能够拮抗一氧化氮对人软骨细胞增殖的抑制作用,其中,中剂量组的作用最强。结论马钱子碱在一定浓度范围内能够有效促进人软骨细胞的增殖。     

Poly—HEMA对大鼠剑突软骨细胞体外培养的影响

目的研究多聚2-羟乙基甲基丙烯酸脂（Poly—HEMA）对体外培养大鼠剑突软骨细胞的生物学特性的影响，对细胞进行纯化过程，并作进一步的细胞形态学及细胞特性鉴定。方法无菌条件下取Wistern大鼠剑突，采用剪碎-酶消化法分离单个软骨细胞，台盼蓝染色鉴定细胞活性。将分离得到的细胞分别接种在预先用Poly—HEMA包被的平皿和普通的平皿内，并将普通平皿的细胞进行差速贴壁。结果从剑突软骨可获得大量软骨细胞，每克软骨可获得软骨细胞3．5×10^7个细胞，活性率为95．23％。软骨细胞在Poly—HEMA包被的平皿内培养使细胞始终呈悬浮状态生长，并能长期保持软骨细胞的特性。在普通平皿内经2次差速贴壁得到的软骨细胞纯度较高，但不转接Poly-HEMA包被的平皿内，细胞经过几次传代，即失去软骨细胞原有的特性。结论从剑突可获得大量软骨细胞，使用Poly—HEMA试剂体外培养的软骨细胞，其软骨细胞能长期以悬浮状态生长，并能使软骨细胞长期保持原有的生物学特性，为体外实验及组织工程学的研究提供更优质种子细胞，为临床的进一步研究提供理论基础。     

IGF-Ⅰ与TGF-β2单独及联合应用对软骨细胞培养的影响

目的 探讨胰岛素样生长因子-1（IGF-Ⅰ）与转化生长因子-β2（TGF-β2）单独及联合应用对软骨细胞形态、增殖速度、黏多糖含量、Ⅱ型胶原含量及表型的影响.方法 采用酶消化法取兔软骨细胞并培养,于第2代时分别加IGF-Ⅰ及 TGF-β2.分为A（空白对照）、B（含IGF-Ⅰ）、C（含TGF-β2）、D（含IGF-Ⅰ及TGF-β2）组.用苏木精-伊红染色法、甲苯胺蓝染色观察软骨细胞形态,MTT法检测增殖速度,阿尔新蓝比色法检测黏多糖含量,免疫组化法检测Ⅱ型胶原含量及表型.结果 在维持细胞形态、细胞增殖速度、Ⅱ型胶原含量及表型方面,D组优于B组,C组次之,A组最差,差异均有统计学意义（P＜0.05）.在促进细胞外基质及黏多糖分泌方面,D组优于C组,B组次之,A组最差（P＜0.05）.结论 IGF-Ⅰ、TGF-β2能维持软骨细胞形态,促进其增殖及Ⅱ型胶原的分泌,并维持其表型,增加细胞外基质及黏多糖的分泌,联合应用有协同作用,可抑制软骨细胞在体外培养过程中的老化.     

体外共培养软骨细胞与脂肪基质细胞用于软骨构建的实验研究

目的：探讨体外共培养软骨细胞与脂肪基质细胞（ADSCs）用于软骨构建的可行性。方法分别收集并培养人ADSCs与猪耳软骨细胞,设置实验组、阳性对照组、阴性对照组,分别接种ADSCs和软骨细胞（以7：3比例混合）、单纯软骨细胞、单纯ADSCs,观察并对比三组的形态学变化、湿重、蛋白多糖含量、组织学特征及Ⅱ型胶原的表达情况。结果经过8周的体外培养,实验组组织形状规则,表现出软骨组织的结构特征,且有一定的弹性;对于平均湿重及蛋白多糖定量检测发现,实验组的平均湿重可达阳性对照组的73.1%、81.9%,与阴性对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）;HE染色显示实验组标本出现连续的软骨样组织,产生成熟的软骨陷窝及纤维性组织,新生软骨厚度较为明显,Ⅱ型胶原免疫组化染色发现,实验组软骨陷窝附近多处呈棕黄色,呈阳性反应。结论软骨细胞及ADSCs体外共培养可用于软骨组织的构建,还需进一步研究确定ADSCs转化为成熟软骨细胞的直接证据。     

Limb bud cell cultures for estimating the teratogenic potential of compounds

Mesenchyme cells, derived from embryonic limb buds, cultured at high cell density, multiply and differentiate into chondrocytes. Using alcian blue, a stain specific for cartilage proteoglycans, the degree of chondrogenesis can be visualized in the micromass cultures as well as quantified by extraction of the stain and spectrophotometric determination of its absorbance. In the presence of active retinoids chondrogenesis is concentration-dependently inhibited. For comparison of the activity of the various retinoids the concentration needed to reduce alcian blue staining by 50% was estimated. In order to validate whether the activity in limb bud cells can predict the teratogenic potential in vivo, the in vitro activity of 25 retinoids was compared with their in vivo teratogenicity observed mainly in rodents. For retinoids which were already in the biologically active form like those with a free carboxylic acid endgroup, there was a good quantitative correlation between the in vitro and in vivo activity. In contrast, the ethylester analog etretinate was slightly active and the ethylamine analog motretinide inactive in vitro but both were teratogenic in vivo. This finding may indicate that these retionoids were not metabolized to the active form in vitro. In conclusion, these results suggest that the limb bud cell culture system may be useful for a preliminary testing to select non-teratogenic retinoids. For the risk assessment in humans, however, the in vitro result should be verified in animal studies.     

循环牵张应力对人骨关节炎软骨细胞增殖的影响

【摘要】目的探讨循环牵张应力对体外培养的人骨关节炎患者软骨细胞增殖的影响。方法退变软骨来源于1例66岁骨关节炎患者的手术取材,病理学诊断评估其退变程度。无菌条件下酶消化法原代培养退变软骨细胞,并用甲苯胺蓝、番红O和Ⅱ型胶原免疫荧光染色进行鉴定。将第3代细胞接种于硅橡胶膜载体上,用Electro?Force3200力学试验仪搭载的BioDynamic生物反应仓对其施加0、5%、10%和15%的应变作用3h,受力完成后继续培养24h,用流式细胞仪测定不同力学环境下细胞的增殖活性。结果随着牵张应力的增加,S期细胞百分比和增殖指数（PI）呈缓慢上升趋势,10%时达到峰值,之后开始下降。结论体外培养的人骨关节炎软骨细胞的增殖活性与受力大小有关,且存在细胞增殖的最适应力条件;超过此应力范围其增殖活性将会降低。     

表没食子儿茶素对LoVo细胞生长周期的影响和诱导其凋亡的研究

目的探讨表没食子儿茶素对体外培养的人大肠癌ＬｏＶｏ细胞株生长周期的影响以及诱导该细胞凋亡的作用。方法用流式细胞术、琼脂糖凝胶电泳、ＨＥ染色观察表没食子儿茶素处理ＬｏＶｏ细胞后其细胞周期的改变以及细胞凋亡形态学和生化方面的改变。结果表没食子儿茶素在低浓度时（３２．５μｍｏｌ·Ｌ－１）对ＬｏＶｏ细胞的周期有明显的影响，主要是Ｓ期和Ｍ／Ｇ２期明显降低，引起ＬｏＶｏ细胞生长阻滞在Ｇ１期；在较高浓度（１６２．５～３２５μｍｏｌ·Ｌ－１）作用２４ｈ，流式细胞仪ＰＩ染色出现亚二倍体峰，ＨＥ染色可见ＬｏＶｏ细胞有典型的凋亡细胞形态改变：细胞变小变圆、固缩，细胞膜出泡，细胞核固缩、边集和碎裂以及凋亡小体的形成；琼脂糖凝胶电泳呈典型的“梯状（Ｌａｄｄｅｒ）”带。结论表没食子儿茶素对体外培养的ＬｏＶｏ细胞具有抑制和杀伤作用，其机制是通过影响ＬｏＶｏ细胞的生长周期和诱导其凋亡而实现。     

周期性张应变力对幼年和成年及骨关节炎软骨细胞产生糖胺多糖的影响

目的观察周期性张应变力（cyclic tensile strain,CTS）对体外培养的幼年、成年及骨性关节炎（Osteoarthritis,OA）兔软骨细胞产生糖胺多糖（Glycosaminoglycans,GAG）的影响。方法取2月龄雄性新西兰大白兔3只作为幼年组,5月龄雄性新西兰大白兔10只,随机分2组（即成年组与OA组）,每组5只。OA组采用前交叉韧带切断术（ACLT）制作OA动物模型,成年组仅行双膝关节切开,但不行ACLT。成年组及OA组动物于术后20周空气栓塞处死,取左侧膝关节标本分别做大体评分及Mankins评分观察OA造模情况。将三组兔膝软骨细胞进行消化分离及体外培养。将每个组原代软骨细胞均分别培养于2个BioFlex6孔培养板上,随机分为对照组细胞和加载组细胞,每组6个样本,同置于培养箱内,加载组每天CTS（sin10%,0.5Hz,6h/次）作用6h,对照组不予特殊处理。加载组与对照组在首次加载后24h、48h与72h分别吸取培养细胞上清液,阿尔新蓝染色沉淀法测定上清液GAG含量,比较各组GAG分泌的变化。结果①实验组动物关节软骨明显退变,大体评分及Mankin＇s评分均明显高于对照组（P〈0.05）;②与对照各组细胞相比,幼年、成年及OA组细胞进行加载后其GAG的分泌水平随时间均升高（P〈0.05）;且各细胞在CTS干预前后GAG分泌随时间变化趋势存在统计学差异（P〈0.05）。结论 Flexercell-4000力学加载系统可对体外培养的软骨细胞施加精确的力学负荷加载,并从刺激各类软骨细胞产生蛋白多糖。与正常细胞相比,OA软骨细胞对力学刺激的响应特点发生了较明显的变化。     

MMP-1在NIV毒素诱导软骨细胞损伤中的表达规律

目的观察NIV毒素对软骨细胞基质金属蛋白酶-1(MMP-1)基因表达的调节作用,在分子水平探讨软骨细胞损伤的机制。方法在体外单层培养的人胚软骨细胞中加入不同浓度(0.025,0.1,0.5 mg.L-1)的NIV毒素,连续作用5 d后收集软骨细胞和细胞培养液,用反转录—聚合酶反应(RT-PCR)检测软骨细胞MMP-1 mRNA表达;用酶联免疫吸附方法(ELISA)测定细胞培养液MMP-1的水平。结果 0.1～0.5 mg.L-1NIV毒素能引起MMP-1 mRNA表达增加(P0.05),并与毒素浓度呈剂量—效应关系;在0.025～0.5 mg.L-1NIV毒素作用下,细胞培养液中MMP-1的含量随毒素浓度升高逐渐增高(P0.05)。结论 NIV毒素可以促进软骨细胞合成MMP-1,这可能在软骨细胞损伤中发挥重要作用。     

菊苣酸对大鼠软骨关节炎的作用及机制

目的: 探究菊苣酸(cichoric acid)对大鼠软骨关节炎的作用及机制。方法: 分离大鼠膝关节处软骨原代细胞,利用白细胞介素1β(interleukin 1 beta, IL-1β)和肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor alpha, TNF-α)诱导软骨关节炎细胞模型,给予低中高剂量的菊苣酸和姜黄素干预。免疫荧光分析Type Ⅱ collagen表达水平,甲苯胺蓝染色和阿利新蓝染色观察干预后软骨关节炎细胞变化,β-半乳糖苷酶染色进行衰老检测,TUNEL染色检测细胞凋亡情况,Western blot检测FOXO4 (forkhead box O4)、p53 (tumor protein P53)和Type Ⅱ collagen蛋白表达水平,生化检测超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD),丙二醛(Malondialdehyde, MDA)和一氧化氮(nitric oxide, NO)含量。结果: 分离得到大鼠软骨原代细胞,IL-1β和TNF-α诱导细胞炎性,甲苯胺蓝染色和阿利新蓝染色面积增加,大鼠软骨关节炎细胞构建成功。与模型组相比菊苣酸高剂量组,甲苯胺蓝染色、阿利新蓝染色、β-半乳糖苷酶染色和TUNEL染色平均光密度比值,MDA含量、NO含量,FOXO4和Type Ⅱ collagen蛋白表达水平显著降低(P＜0.05),p53蛋白表达水平,SOD含量显著增加(P＜0.05)。结论: 菊苣酸阻止软骨关节炎导致的细胞衰老,抑制软骨关节炎导致的细胞凋亡,进而阻止原代细胞中软骨关节炎的进展,其机制与菊苣酸下调FOXO4蛋白参与的衰老进程相关。