白杨素对5- 氟尿嘧啶诱导人肝癌Bel-7402 细胞凋亡的增敏机制研究

目的 探讨白杨素对5- 氟尿嘧啶（5-FU）诱导肝癌Bel-7402 细胞凋亡的增敏作用。方法 白 杨素单独或联合5-FU 作用Bel-7402 细胞,用MTT 法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡与周期分 布变化;Western blotting 检测Bcl-2、Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 蛋白。结果 50 ～ 250μmol/L 白杨 素作用Bel-7402 细胞48 h 呈浓度依赖性的抑制细胞活力,且100μmol/L 白杨素组细胞存活率为（82.261± 7.793）%。100μmol/L 白杨素单独作用24 h 对Bel-7402 细胞活力和凋亡均无影响（P >0.05）。与空白对照 组比较,100μmol/L 白杨素作用24 h 后,不同浓度5-FU（12.5、25.0 及50.0μg/ml）作用48 h 对Bel-7402 细胞活力的抑制作用增强（P <0.05）;25.0μg/ml 5-FU 诱导Bel-7402 细胞凋亡率增加（P <0.05）;G2/M 期 细胞比例升高（P <0.05）;促凋亡蛋白Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 蛋白表达水平上调（P <0.05）;抗凋亡 蛋白Bcl-2 表达水平下调（P <0.05）。结论 白杨素增强5-FU 诱导人肝癌Bel-7402 细胞凋亡,其机制可能 与线粒体凋亡通路激活有关。     

甘草查尔酮类化合物对人肝癌Bel-7402细胞的抗癌活性研究

目的以天然查尔酮类化合物异甘草素(ILG)为先导物进行结构修饰,制备3-甲氧基异甘草素(3-MO-ILG),并研究ILG与3-MO-ILG的体外抗癌活性。方法利用酸催化的羟醛缩合反应制备ILG与3-MO-ILG目标化合物;应用人肝癌Bel-7402细胞为体外模型,用MTT法观察2种化合物对肝癌细胞增殖的抑制活性;用流式细胞仪测定促Bel-7402细胞凋亡能力;用张氏肝细胞(chang liver)测定对正常细胞的毒性。结果化合物ILG和3-MO-ILG对正常肝细胞无明显毒性,而对肝癌Bel-7402细胞的增殖有一定的抑制活性,浓度在5～200μg/mL范围内,对肝癌Bel-7402细胞的抑制率分别为23.28%～80.01%及41.96%～86.10%;2种化合物对肝癌细胞有明显的促进凋亡作用,最高凋亡率分别可达85%和93.5%。结论人肝癌Bel-7402细胞对甘草查尔酮类化合物具有较高的敏感性;ILG衍生物对人肝癌Bel-7402细胞增殖的抑制活性呈浓度依赖性,而对正常细胞的毒性明显小于对癌细胞的毒性;其抗癌作用机制可能是通过增殖抑制和促进凋亡来产生。本研究为甘草查尔酮类化合物中筛选抗肝癌候选药物奠定一定基础。     

白杨素敏化rhsTRAIL诱导人肝癌Bel-7402细胞凋亡

目的:研究白杨素(ChR)是否具有增敏重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(rhsTRAIL)诱导人肝癌Bel-7402细胞凋亡作用。方法:体外培养人肝癌Bel-7402细胞。碘化丙啶(PI)染色流式细胞术(FCM)分析细胞死亡率。DNA琼脂糖凝胶电泳确证诱导细胞凋亡作用。Western Bloting检测细胞DR5蛋白的表达。结果:ChR40μmol/L、rhsTRAIL 100ng/mL以及两者合用的细胞死亡率分别为4.91%±0.38%、5.89%±0.39%和28.7%±2.50%。ChR(40μmol/L)联合rhsTRAIL(100ng/mL)处理48小时,人肝癌Bel-7402细胞展示出典型DNA梯形条带图谱。Western Blot分析结果发现:白杨素以浓度和时间依赖的方式上调Bel-7402细胞DR5表达。结论:亚细胞毒性浓度的白杨素具有敏化rhsTRAIL诱导人肝癌Bel-7402细胞凋亡作用。     

祁连圆柏提取物诱导人肝癌细胞Bel-7402凋亡的作用及筛选研究

目的探讨祁连圆柏提取物体外对人肝癌细胞Bel-7402体外增殖抑制、凋亡作用机制并进行有效组分筛选研究。方法采用硅胶柱层析法提取祁连圆柏有效抗瘤组分,分光光度法测定含量。用克隆形成实验、台盼蓝拒染法及MTT显色法检测祁连圆柏提取物对Bel-7402细胞增殖的影响,流式细胞术检测其诱导细胞凋亡的细胞周期阻滞状况及凋亡率,免疫组化观察对Bcl-2与Bax蛋白的表达水平,光镜、电镜观察凋亡细胞的组织形态和超微结构变化。结果祁连圆柏提取物对Bel-7402细胞增殖有明显的抑制作用,其中C液-组分-3细胞的半数抑制浓度为2.47μg/ml。流式细胞检测结果 G0/G1期细胞增多,G2/M期细胞减少,其中10～50μg/ml的祁连圆柏C液-组分-3在G1期细胞前出现典型"凋亡峰";免疫组化SP法检测实验组细胞BCL-2基因蛋白表达降低,Bax基因蛋白表达增加。光镜与电镜下均见凋亡细胞明显增多。结论祁连圆柏C液-组分-3具有显著的抑制Bel-7402细胞增殖以及诱导该细胞系凋亡的作用,其诱导Bel-7402细胞凋亡的作用与其上调Bax、下调Bcl-2蛋白的表达,激活Bax凋亡基因蛋白及G0/G1期阻滞有关,是其重要的抗肿瘤作用机制。     

人参皂苷Rh2对人肝癌Bel-7402细胞增殖和凋亡的影响

目的观察人参皂苷Rh2对人肝癌Bel-7402细胞增殖和凋亡的影响,并初步研究其机制。方法将Bel-7402细胞与人参皂苷Rh(2200、100和50μg/mL)共同培养48 h。MTT法检测人参皂苷Rh2对Bel-7402细胞增殖的影响;流式细胞仪分析细胞周期中各时期的细胞百分数;TUNEL技术检测其对Bel-7402细胞凋亡的影响;Western blotting法检测Bel-7402细胞中Bcl-2、Bax的蛋白表达。结果 MTT结果显示,人参皂苷Rh2能抑制Bel-7402细胞的生长;流式细胞检测显示,人参皂苷Rh2能使细胞停滞于G1期;TUNEL结果显示,人参皂苷Rh2能有效诱导Bel-7402细胞凋亡;Western blotting结果显示,人参皂苷Rh2能上调Bel-7402细胞中Bax的表达,下调Bcl-2的表达。上述结果均在一定程度上呈量效关系。结论人参皂苷Rh2能抑制Bel-7402细胞生长并促进其凋亡,其作用机制可能为上调Bax和下调Bcl-2。     

桂皮酸诱导Bel-7402人肝癌细胞凋亡的作用及机制

[目的]通过检测不同浓度的桂皮酸对人肝癌Bel-7402细胞生存率及凋亡的影响,明确中药桂皮酸诱导该肿瘤细胞凋亡的作用和机制.[方法]采用MTT法检测0、1、3、5和10 mmol/L桂皮酸对正常肝细胞CL48及人肝癌细胞Bel-7402生存率的影响;采用PI/Annexin V双染法检测O、1、3、5和10 mmol/L桂皮酸对Bel-7402细胞凋亡作用的影响;应用Western-blot技术检测不同浓度桂皮酸对Bel-7402细胞中Bax、cytochrome c、caspase 8、caspase 9及caspase 3的作用.[结果]MTT结果显示桂皮酸能剂量依赖性地抑制Bel-7402细胞的生长,而对正常肝细胞的生存率无影响,P＜0.05.PI/Annexin V双染法,流式细胞仪检测显示空白对照组细胞凋亡率为(5.43±0.57)％,浓度为1、3、5和10mmol/L的桂皮酸处理组细胞凋亡率分别为(7.37±0.74)％、(13.73±1.5)％、(25.67±2.15)％和(52.23±4.18)％.蛋白质印迹法结果显示,桂皮酸能促进Bel-7402细胞caspase 8、caspase 9及caspase 3的切割;促进Bax蛋白转位至线粒体及cytochrome c的释放.[结论]桂皮酸具有抑制肝癌Bel-7402细胞生长及促进其凋亡的作用,可能是通过促进Bax蛋白转位至线粒体,从而刺激cytochrome c释放至胞浆,激活caspase蛋白导致肿瘤细胞凋亡.     

外加极低频交变磁场照射下致吸附纳米FeOx颗粒不同类型肝癌细胞凋亡研究

目的:观察纳米FeOx粒子在100Hz外加极低频交变磁场(extremely low frequency altering electric-magnetic field, EMF)作用下导致的Bel-7402及HepG2两种肝癌细胞凋亡现象,并探讨其分子机制?方法:采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测纳米粒子在EMF作用下对不同类型体外培养肝癌细胞Bel-7402及HepG2增殖的影响,流式细胞仪检测不同实验条件下细胞发生的早期凋亡及死亡,运用Western-blot检测细胞凋亡相关蛋白Bcl家族及热休克蛋白-27(Hsp-27)的表达以确定其对细胞影响的分子机制?结果:EMF照射纳米FeOx颗粒吸附HepG2和Bel-7402细胞增殖抑制率分别为(35.54±3.2)%?(76.31±2.3)%(P < 0.05),凋亡率分别为(18.64±6.68)%?(23.34±2.16)%(P > 0.05),两种细胞凋亡率差异不显著?Western-blot实验结果表明两种细胞的Bcl蛋白家族大量表达,细胞发生明显早期凋亡,其中Bel-7402细胞的Bcl/Bax值明显低于HepG2细胞的比值,而Hsp-27蛋白表达明显高于HepG2细胞中的表达,Bel-7402细胞的自我保护功能表现得更为显著,两种细胞的凋亡率度未出现明显差异?结论:EMF照射磁性纳米FeOx颗粒吸附得两种肝肿瘤细胞均能抑制细胞增殖并导致细胞发生大量的早期凋亡,可作为一种潜在的治疗肝脏肿瘤细胞的手段?     

姬松茸多糖诱导Bel-7402细胞凋亡的实验研究

目的研究姬松茸多糖(PAB)对人肝癌细胞Bel-7402凋亡的影响及其机制。方法用不同浓度的PAB与小鼠脾淋巴细胞共同培养制备上清;应用流式细胞术分析各组Bel-7402细胞凋亡情况、细胞内p53蛋白的表达以及肿瘤细胞内Ca2 水平的变化;应用透射电子显微镜观察细胞超微结构变化;应用荧光显微镜观察细胞内p53蛋白表达的变化。结果与阴性对照组相比较,通过流式细胞仪检测,治疗组细胞凋亡率和细胞内Ca2 水平显著升高(P<0.01);通过流式细胞仪和荧光显微镜检测细胞内p53蛋白的表达无显著差异,透射电子显微镜观察显示出细胞凋亡的典型形态学变化。结论PAB具有诱导Bel-7402细胞凋亡的作用。     

参芍消瘤方含药血清对人肝癌细胞生物学行为的影响

目的探讨参芍消瘤方含药血清对人肝癌细胞Bel-7402增殖、凋亡、细胞周期等生物学行为的影响及其作用机制。方法使用SD大鼠制备参芍消瘤方含药血清。将Bel-7402分为对照组、含药血清组（25%含药血清）、顺铂组（5mmol/L顺铂）、含药血清+顺铂组（25%含药血清+5mmol/L顺铂）。采用5-乙炔基-2''脱氧尿嘧啶核苷（EdU）染色法检测细胞增殖情况;采用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率;采用划痕法检测细胞迁移能力;采用Transwell法检测细胞侵袭能力;采用Westernblot法检测细胞磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）蛋白表达水平。结果与对照组比较,含药血清组和顺铂组细胞增殖数量减少,侵袭能力下降,磷酸化PI3K（p-PI3K）、磷酸化Akt（p-Akt）蛋白表达水平降低,划痕速度减慢,凋亡率、S期细胞占比升高,Caspase-3蛋白表达水平升高,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与顺铂组比较,含药血清+顺铂组细胞增殖数量减少,侵袭能力下降,p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平降低,划痕速度减慢,凋亡率、S期细胞占比升高,Caspase-3蛋白表达水平升高,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论参芍消瘤方含药血清可抑制Bel-7402细胞增殖、迁移、侵袭,诱导细胞周期阻滞,促进细胞凋亡,其作用机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路有关。     

新型钌配合物通过内源性线粒体凋亡通路诱导Bel-7402细胞凋亡的机制

目的 研究钌配合物Ru-HMIP对肝癌细胞Bel-7402的抑制作用及其机制.方法 MTI法检测RuHMIP对Bel-7402细胞的杀伤作用;流式细胞术检测其诱导细胞凋亡情况;JC-1荧光探针检测线粒体膜电位;DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(ROS);Western blot检测细胞凋亡相关蛋白.结果 RuHMIP对Bel-7402细胞有较强的杀伤效果;其对细胞毒性作用是通过诱导细胞凋亡方式;Ru-HMIP在Bel-7402细胞中产生过量ROS,并且这种作用及其细胞毒性都可被还原剂乙酰半胱氨酸(NAC)所阻断.Ru-HMIP可以破坏Bel-7402细胞线粒体膜电位;上调Bax,下调Bcl-2,同时激活Caspase-9及Caspase-3.结论 Ru-HMIP可以在体外有效抑制Bel-7402细胞增殖,其作用机制是在细胞内诱发过量ROS,继而通过内源性线粒体凋亡通路诱导细胞凋亡.     

表没食子儿茶素没食子酸酯诱导肝癌细胞凋亡并伴随端粒酶活性下调

目的 :探讨表没食子儿茶素没食子酸酯 (EGCG)对肝癌细胞凋亡和端粒酶活性的影响。方法 :用MTT法测定EGCG的细胞毒 ,以荧光显微镜、流式细胞仪研究细胞凋亡 ,PCR -ELISA法测定细胞端粒酶活性。结果 :EGCG作用Bel- 74 0 2肝癌细胞后 ,荧光显微镜观察到细胞凋亡现象。在一定时间、一定剂量范围内 ,EGCG诱导细胞凋亡呈现浓度和时间依赖性 ,而端粒酶活性随EGCG诱导Bel - 74 0 2细胞凋亡的发生而逐渐降低。结论 :EGCG可通过下调端粒酶活性诱导BEL - 74 0 2细胞凋亡 ,这可能是茶叶有效成分抗肿瘤的重要机制之一。     

舟山眼镜蛇毒及其有效组分体内外抑瘤的作用

目的：观察蛇毒（SV）及其有效组分体内外的抗癌活性,为SV抗肿瘤新药的开发提供实验依据。方法：采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）筛查不同浓度（5—20mg／mL）SV及其7种分离组分对人结肠癌细胞株（HCT-8）、人肝癌细胞株（Bel-7402）、人口腔上皮癌细胞株（KB）、人乳腺癌细胞株（MCF-7）的影响;并用小鼠肝癌（H22）动物移植瘤作为实验动物模型,进一步观察SV及其组分Ⅳ（0．01-0．03mg／kg）对瘤重、脾重、外周血白细胞和体质量的影响。结果：SV、Ⅲ2和Ⅳ的肿瘤抑制作用较为明显,三者的浓度在20μg／mL时,对HCT-8、Bel-7402、KB以及MCF-7具有非常显著的抑制作用,对HCT-8的抑制率分别为84．37％、79．39％和85．78％;对Bel-7402的抑制率分别为89．64％、88．13％和92．08％;对KB的抑制率分别为90．08％、91．30％和93．93％;对MCF-7的抑制率分别为89．88％、89．49％和92．33％。腹腔注射10d后,组分Ⅳ对H22有明显的抑制作用,SV组分Ⅳ3个浓度组的瘤重分别为（0．81±0．20）g、（0．70±0．18）g、（0．61±0．17）g,均明显低于对照组瘤重[（1．19±0．21）g,P〈0．05],肿瘤生长抑制率（IR）分别为31．93％、41．17％和48．73％。Ⅳ各剂量组小鼠脾脏指数较对照组增加,白细胞数与对照组相比无明显变化。结论：SV及其7种分离组分均能有效抑制4种人肿瘤细胞株（HCT-8、Bel-7402、KB及MCF-7）的生长,不同的SV分离组分对同一肿瘤细胞抑制作用有差异;不同肿瘤细胞对同一SV分离组分的反应性也不同。SV分离组分Ⅳ对动物移植性肿瘤小鼠肝癌H22有良好的实验疗效。     

Hepsin蛋白对肝癌细胞生长的影响

目的:探讨Hepsin蛋白对肝癌细胞生长和细胞凋亡的影响。方法:运用RT-PCR技术检测肝癌组织样品肝癌细胞系中Hepsin基因的表达水平,并从原发性肝癌患者的癌组织中扩增Hepsin基因编码区序列,该序列被克隆并构建pCMV-tag-HS表达质粒。将pCMV-tag-HS表达质粒转染人肝癌细胞系HepG2细胞、Bel-7402细胞,观察Hepsin蛋白对肝癌细胞的增殖能力和细胞凋亡效应的影响。结果:Hepsin基因在临床肝癌组织和人正常肝细胞L-02细胞中高表达,在人肝癌细胞系Bel-7402细胞、HepG2细胞和临床肝癌癌旁组织不表达或低表达,Hepsin蛋白可以增强肝癌细胞系的增殖能力,同时抑制肝癌细胞凋亡。结论:Hepsin蛋白促进肝癌细胞生长并抑制肝癌细胞凋亡。     

人B7-2基因修饰的食管癌细胞瘤苗抗肿瘤的免疫效应

目的:研究人B7-2基因修饰的食管癌细胞作为瘤苗的抗肿瘤作用。方法:将真核荧光表达载体pEGFP-C3-B7-2,通过脂质体转染技术转染人食管癌细胞株EC9706。外周血来源的树突状细胞(DC)负载肿瘤抗原后,与自体T淋巴细胞共培养3d,获得细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测CTL对转染和未转染pEGFP-C3-B7-2的人食管癌细胞EC9706的杀伤活性。结果:CTL对转染pEGFP-C3-B7-2的肿瘤细胞的杀伤活性大于转染pEGFP-C3和未转染细胞的杀伤活性(P<0.05)。结论:人B7-2基因修饰的EC9706肿瘤细胞瘤苗,可诱导出明显的抗EC9706细胞的免疫效应。     

沉默GPC-3基因转录对裸鼠肝癌移植瘤的抑制作用

目的：研究沉默磷脂酰肌醇蛋白多糖-3（glypican-3,GPC-3）基因转录抑制肝癌HepG2细胞裸鼠移植瘤生长与机制。方法：以人GPC-3基因序列设计并合成miRNA,构建GPC-3-miRNA干扰质粒。将其导入HepG2细胞,通过杀稻瘟菌素筛选出稳定株,移植裸鼠皮下成瘤。根据体积的均数值绘制肿瘤生长曲线,免疫组化法检测瘤组织内GPC-3、β-catenin、p-GSK3β及cyclinD1表达。结果：肝癌HepG2、Hep3B 和 MHCC-97H 细胞 GPC-3表达较强（50%～80%）, SMMC-7721和Bel-7402细胞中等（18%～25%）,PLC/PRF/5和Bel-7404细胞较弱（8%～10%）。以特异miRNA干预GPC-3基因转录,明显抑制 HepG2细胞增殖,呈时间依赖性;沉默 GPC-3能明显抑制裸鼠皮下移植瘤生长,且瘤组织β-catenin、p-GSK3β及cyclinD1等关键信号分子表达降低。结论：沉默GPC-3影响Wnt/β-catenin通路关键信号分子表达可能是抑制HepG2增殖的分子机制。     

腺病毒介导的p27mt基因转染对肝癌细胞及裸鼠移植瘤的生长抑制作用

目的:研究携带突变型p27的重组腺病毒(Ad-p27mt)基因转染对肝癌的体内、外抑制作用,并探讨其抑癌机制。方法:⑴将Ad-p27mt转染人肝癌细胞SMMC-7721,Western blotting检测P27、Bcl-2、Bax的表达;流式细胞仪(FCM)观察Ad-p27mt对肝癌细胞生长抑制作用。⑵Ad-p27mt直接注射入人肝癌裸鼠移植瘤中,绘制肿瘤生长曲线,计算肿瘤生长抑制率。结果:Ad-p27mt转染肝癌细胞后,细胞增殖明显受抑制,G0/G1期细胞比例增加,P27表达增强,Bax/Bcl-2比例增高,采用Ad-p27mt基因治疗肝癌裸鼠移植瘤生长受抑制,肿瘤生长抑制率达57.09%。结论:Ad-p27mt基因转染对肝癌具有较显著的体内、外抑制作用和诱导凋亡作用,其机制是通过增强P27表达,使细胞产生周期阻滞,诱导凋亡的机理可能是上调Bax/Bcl-2比例所引起。     

靶向4-1BBL基因siRNA抑制HL-60B细胞生长的体外研究

目的：观察4-1BBL基因小分子干扰RNA（siRNA）对HL-60细胞生长及诱导其凋亡作用的影响。方法：化学合成法合成靶向人4-1BBL基因siRNA,脂质体转染法转染HL-60B细胞;半定量PCR和流式细胞术检测转染前后HL-60B细胞4-1BBL的表达水平,MTT法检测HL-60B细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。结果：靶向4-1BBL基因siRNA转染HL-60B细胞后,4-1BBLmRNA和蛋白的表达明显降低;细胞增殖被抑制,其抑制作用在转染后48h最明显,增生抑制率达到（22.1±2.3）%;细胞凋亡率增加,由（9.8±2.5）%上升到（32.5±5.1）%。结论：化学合成的siRNA在体外能成功抑制靶基因4-1BBL的表达和HL-60B细胞的增殖,并有助于细胞趋向凋亡。